准备做组织蛋白，怎么准备蛋白样品呀？跟跑wb的提蛋白要求是一样的吗？

组织样本的蛋白质制备与WB的样品制备有些许不同，主要因为蛋白质组学分析（如质谱分析）对样品纯度和处理过程的要求更为严格。以下是两种方法在样品制备上的主要区别：

1. 裂解缓冲液

• • 质谱分析：通常使用不含表面活性剂或只含少量表面活性剂的缓冲液（如8 M 尿素或4% SDS），避免影响质谱分析。
  • Western Blot：可以使用含有较多表面活性剂的RIPA缓冲液或其他类型的裂解缓冲液，这些表面活性剂有助于蛋白质的提取和溶解。

 

2. 酶抑制剂和其他添加剂

• • 质谱分析：必须谨慎选择添加剂，避免使用可能干扰质谱检测的化合物，如某些盐类、去垢剂和稳定剂。
  • Western Blot：通常会添加蛋白酶抑制剂，以防止蛋白降解，对检测材料的选择相对宽松。

 

3. 样品处理和消化

• • 质谱分析：蛋白质常需要进行酶解处理，如用胰蛋白酶处理，生成肽段进行MS分析。
  • Western Blot：蛋白质通常在加载前通过SDS-PAGE直接分离，不需要酶解步骤。

 

4. 样品处理和消化

• • 质谱分析：样品在分析前需要通过各种方法（如固相萃取）清除可能干扰分析的杂质。
  • Western Blot：这一步通常不必须，除非样品中包含极大量的杂质。

 

下面是组织蛋白制备的详细步骤：

1. 样品收集和储存：

• • 确保在收集组织样本后立即将其冷冻在液氮中，或者-80°C冷冻保存以防止蛋白质降解。

 

2. 匀浆和裂解：

• • 使用物理或化学方法破碎组织，如用匀浆机在冷冻条件下匀浆。可以使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）来提取蛋白质，以防止蛋白质在提取过程中被降解。

 

3. 裂解缓冲液的选择：

• • 对于质谱分析，通常需要避免使用含有重金属离子或过多的表面活性剂的缓冲液，因为这些成分可能会干扰质谱检测。

 

4. 蛋白质定量和质控：

• • 使用BCA或Bradford蛋白定量法对提取的蛋白进行定量，确保样品中蛋白浓度适合后续分析。
  • 通过SDS-PAGE等方法检查蛋白样品的完整性和纯度。

 

5. 蛋白质消化：

• • 在进行质谱分析前，通常需要将蛋白质进行酶解，常用的酶如胰蛋白酶（Trypsin）进行消化，以生成适合质谱分析的肽段。

 

6. 样品清洁和富集：

• • 使用适当的方法（如固相萃取SPE）去除样品中的杂质，增强肽段的信号。

 

7. 质谱分析：

• • 样品制备完成后，可以进行LC-MS/MS分析，根据实验的设计进行定量或定性分析。

 

百泰派克生物科技--生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

 

相关服务：

蛋白质质谱鉴定

蛋白鉴定

Shotgun鸟枪法蛋白质鉴定

Pull-down靶蛋白质谱鉴定