使用一个dss交联剂跑ip和多聚化蛋白wb的方法

DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯）交联剂可以帮助稳定蛋白间相互作用，使免疫共沉淀（IP）和后续的Western Blot（WB）分析更有效。下面为您提供使用DSS 进行IP和多聚化蛋白的WB分析的方法：

1. 交联

• 准备样品：从细胞或组织中提取蛋白质，并调整蛋白浓度。
• 添加DSS：向蛋白样品中加入DSS交联剂。DSS是一种常用的可逆交联剂，能够在蛋白质的赖氨酸残基间形成共价键。
• 孵育：在室温下或适当温度下孵育一定时间，通常为30分钟至数小时，具体时间依赖于实验目的和交联效率。
• 终止反应：通过添加Tris缓冲溶液（通常为1M pH 7.5）终止交联反应。

 

2. 免疫共沉淀 (IP)

• 清洗细胞裂解物：使用适当的裂解缓冲液制备细胞裂解物，清除非溶解的成分。
• 预清除：使用A/G珠子预清除样品中的非特异性结合。
• 抗体孵育：加入针对目标蛋白的特异性抗体，通常在4°C下过夜孵育。
• 加入蛋白A/G珠子：将已经与抗体结合的样品与蛋白A或G珠子孵育，以捕获抗体-抗原复合物。
• 洗涤和沉淀：用IP缓冲液洗涤珠子数次，去除未结合的蛋白和其他杂质。
• 洗脱：使用SDS样品缓冲液洗脱抗原蛋白。

 

3. Western Blot (WB)

• 制备样品：将IP过程中洗脱的蛋白样品加热，在SDS-PAGE凝胶上进行电泳。
• 转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。
• 封闭：使用5%脱脂奶粉或BSA封闭膜，防止非特异性结合。
• 抗体探测：首先使用一抗（针对目标蛋白的抗体）孵育，然后用相应的HRP标记的二抗孵育。
• 信号检测：使用化学发光底物进行信号检测，并通过X光片或数字成像系统捕捉信号。

 

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