外泌体蛋白质谱

外泌体是一种直径介于30～150nm之间的脂质双层膜小囊泡，由活体细胞分泌产生，广泛存在于人体各种体液中，包括血液、唾液、尿液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。外泌体中富含着大量的生物活性分子，如核酸、蛋白质、脂类和糖类等，是细胞间传递生物信息的重要载体，在生理调节和病理发展中都发挥重要作用，因此成为近年来研究的热点。

目前，对外泌体内 miRNA 的临床生物学意义研究已经非常深入。随着质谱技术的不断发展,蛋白质作为诸多生物功能的直接执行者受到越来越多的关注，尤其是外泌体内的蛋白质及其生物功能。相较于RNA分子，蛋白分子更加稳定，对细胞内活动影响更加直接，经外泌体介导进入受体细胞后能立即发挥活性。质谱技术用于外泌体蛋白有助于阐明疾病的发生和发展机制，进而寻找特异性的生物标志物和可用于精准治疗的靶点。

随着外泌体相关研究数量日益增加,基于质谱技术的外泌体蛋白质组学研究策略也逐渐完善。用于蛋白质组学研究的质谱技术与常规蛋白质组学研究一致，可分为非靶向蛋白质组学质谱技术和靶向蛋白质组学质谱技术，其中非靶向蛋白质组学质谱技术是检测样本中所有在检测限范围内的蛋白质，多用于外泌体内差异蛋白质的筛选或信号通路分析，包括标记定量（体外和体内）和非标记定量。而靶向蛋白质组学质谱技术是对数十个目标蛋白质进行检测,多用于已知蛋白质的验证，包括多反应监测质谱技术(MRM)和平行反应监测质谱技术(PRM) 等。

图1.用于外泌体蛋白组学的质谱技术的研究的流程

1.非靶向蛋白质组学质谱技术

图2.非靶向外泌体蛋白组学质谱技术流程

1.1标记定量技术

1.1.1体外标记定量技术

目前，常用于外泌体蛋白质组学研究的体外标记定量技术主要包括TMT和iTRAQ 两种，均采用同位素与肽段的氨基反应,通过等重标记原理对不同样本进行标记，同时上机检测不同样本的同一肽段在质谱仪中的离子信号响应强度，实现所有蛋白质的相对定量。TMT和iTRAQ 的主要差别在于标记样本的数量不同。TMT是由Thermo Fisher Scientific公司研发，适用于2 、6、10 或16标；而iTRAQ 是由AB Sciex公司研发，适用于4或8标。

图3.iTRAQ/TMT技术研究流程

1.1.2体内标记定量技术

SILAC是一种体内标记技术，它先将轻、中、重型C/N同位素标记在L-赖氨酸和L-精氨酸两种必需氨基酸上，然后将标记了同位素的氨基酸与细胞共培养(>5代)或饲养正常的动物，通过正常细胞代谢实现95%及以上的蛋白质标记，适用于2标或3标。在外泌体蛋白质组学的研究中，SILAC主要用于细胞株来源的外泌体。由于无需体外人工标记处理，对蛋白质标记的保真性较高。

1.2非标记定量技术

非标记定量技术是通过比较不同样本中同一肽段对应的质谱峰面积或质谱峰强度，直接获取该肽段所代表的蛋白的相对定量信息。相对于标记定量而言，非标记定量可用于任何类型的样本，并且无需前期复杂的标记技术，少了标记步骤，减小了标记时导致的误差。而且因为每个样品是分开进行分析的，所以解决了分析样品数量的烦恼，甚至可以实现同时多组生物样品的高通量定量分析。

2.靶向蛋白质组学质谱技术

2.1多反应监测质谱技术(MRM)

MRM的原理是在一级质谱中设定目标蛋白相应的母离子信息，在二级质谱中设定相应子离子信息，通过选择性地采集母离子-子离子对信号，从而实现目标蛋白的相对定量。

2.2平行反应监测质谱技术(PRM)

2012年，PETERSON提出了利用高分辨率的质谱仪(orbitrap/TOF)取代三重四极杆中第三级的四极杆质量器采集所有子离子信息，进而对目标蛋白定量，即PRM。随着技术的成熟和方法学的完善，PRM 用于外泌体蛋白质组学的研究逐渐增多。PRM衍生于MRM，结合了四级杆的高选择性以及Orbitrap的高分辨和高精度的特性，在对选定的母离子进行裂解后会测量所有的碎片离子，具有更好的检测灵敏度和抗干扰能力。

图4.靶向蛋白组学质谱技术流程（SRM/MRM、PRM）

表1.常用于蛋白质组学研究的质谱技术的优点和局限性

蛋白质组学质谱技术	优点	局限性
非靶向蛋白质组学质谱技术
非标记定量技术
DDA	无需标记；操作简单；样本数量、种类不限；数据库完善	批间重复性较差；易遗漏低丰度蛋白
DIA	无需标记；操作简单；样本数量、种类不限；不受高丰度蛋白影响；重现性和稳定性较高	数据处理复杂；需单独建立数据库
标记定量技术
TMT	覆盖度高；无批间重复	标记有限；操作复杂；样本较多时候需设置纠偏；对样本数量有限制
SILAC	标记效率高；重复性好；保真性高	仅适合于传代细胞；周期较长；仅比较两组或3组
靶向蛋白质组学质谱技术
MRM、PRM	灵敏高；准确性好；检测时间短；可实现绝对定量	仅可用于有限蛋白验证；不适合于蛋白筛选

来源：国际检验医学杂志，2021，42（16）

目前，随着疾病的多样化，传统的诊疗手段已满足不了人们对疾病诊疗的期望，应运而生的精准医学成为热门的话题，而外泌体蛋白质组学代表细胞的特定标记，能最大程度地反映细胞的状态，因此成为疾病诊疗的标志物的候选者。质谱技术由于灵敏度高、特异性强、分析范围宽等特点已逐渐成为蛋白质组学的主要研究手段。百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪，结合nanoLC-MS/MS纳升色谱可对外泌体蛋白质组学进行高效精准的鉴定分析。此外本司提供一站式服务，从前期的样品外泌体分离到后期标志物的检测，我们都配置有专业的人员，欢迎您的咨询。

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