iTRAQ 是相对定量还是绝对定量？原理、流程与适用场景
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通道数有限，复杂设计需要拆批或改用更高 plex 策略。
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标记效率、样品等量和混合比例会影响定量准确性。
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共碎裂和共洗脱可能造成比值压缩。
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绝对定量需要内标和校准设计，不是常规流程自动产出。
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复杂样本建议增加分级深度和生物学重复。
iTRAQ 的全称是 Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，中文常译为“相对和绝对定量同位素标记”。在实际蛋白组学项目中，它最常用于多组样品之间的相对定量：不同样品用不同同重标签标记，混合后上机，通过 MS/MS 中 reporter ion 的峰强度比较各样品丰度。若加入已知量的内标肽并建立校准关系，也可以服务于特定肽段或蛋白的绝对定量。
关键要点
| 关键问题 | 简短结论 |
|---|---|
| iTRAQ 默认更常做什么？ | 多组样品的相对定量。 |
| 为什么名字里有 absolute？ | 结合已知量内标肽时，可对目标肽段做绝对定量。 |
| 定量信号来自哪里？ | MS/MS 中释放的 reporter ions 峰强度或峰面积。 |
| 常见通道数是多少？ | 经典 iTRAQ 有 4-plex 和 8-plex。 |
| 主要风险是什么？ | 标记效率、通道设计、共碎裂和比值压缩。 |
它是什么？
iTRAQ 是一种体外肽段标记技术。不同样品经蛋白提取和酶切后，用不同同位素组成、但总体质量相近的 iTRAQ 标签标记。标记后的样品混合进入 LC-MS/MS，在一级质谱中同一肽段不同通道通常共洗脱；到了二级质谱，标签释放出不同质量的报告离子，软件根据报告离子的相对强度计算样品之间的丰度比。
这也解释了为什么 iTRAQ 常被用于相对定量。它最擅长回答“处理组相对对照组升高还是降低”“多个时间点哪个更高”“不同组之间差异倍数是多少”。绝对定量不是不能做，但需要额外的标准品、内标肽和校准设计，不能只靠常规 iTRAQ 流程自动得到。
相关服务
iTRAQ 流程怎么走？
典型流程包括样品分组、蛋白提取、酶切、iTRAQ 标记、等量混合、肽段分级、LC-MS/MS、数据库检索、reporter ion 定量、归一化、差异蛋白筛选和生物信息学分析。4-plex 或 8-plex 可以把多个组别放在一次标记体系里比较，但生物学重复仍然不能省略。
标记效率是关键质控点。如果标记不完全，后续比值会被拉偏。另一个常见问题是比值压缩：共碎裂、共洗脱和复杂背景可能让真实差异被压小，所以复杂样品常需要更好的分级和合适的数据分析策略。
iTRAQ、TMT、SILAC、Label-free 怎么区分？
iTRAQ 和 TMT 都属于同重标签，适合多组样品在同一次质谱流程中比较。SILAC 是体内代谢标记，更适合可培养细胞体系。Label-free 和 DIA 不需要化学标签，样本扩展更灵活，但对色谱稳定性、批次控制和统计模型要求更高。
| 策略 | 主要特点 | 适合场景 | 主要限制 |
|---|---|---|---|
| iTRAQ | 体外同重标签，4/8 通道 | 多组相对定量 | 比值压缩、标记效率 |
| TMT | 同重标签，通道数更高 | 多条件高通量比较 | 成本和共碎裂问题 |
| SILAC | 体内代谢标记 | 细胞培养体系 | 不适合多数临床组织 |
| Label-free | 不标记，样本扩展灵活 | 大样本发现型研究 | 批次和缺失值控制 |
| DIA | 数据非依赖采集 | 稳定深度定量 | 谱库/算法和方法开发 |
主要收益或优势
1、适合多组样品同步比较
iTRAQ 可以把多组样品标记后混合，减少部分上机批次差异。对于处理组、对照组、时间点或剂量梯度比较，这种设计很直观。
2、能同时获得鉴定和定量信息
LC-MS/MS 既用于肽段和蛋白鉴定，也读取 reporter ions 进行定量，因此适合发现型差异蛋白研究。
3、可与后续验证衔接
iTRAQ 筛出的差异蛋白，可以进一步用 PRM、MRM、Western blot 或功能实验验证。发现型数据不应直接替代验证。
主要限制或权衡
FAQ
1、iTRAQ 到底是相对定量还是绝对定量？
常规项目中主要用于相对定量。若加入已知量内标肽，并用同样标签体系建立标准曲线或校准关系，则可用于特定目标的绝对定量。
2、iTRAQ 和 TMT 哪个更好？
没有绝对更好。两者都属于同重标签定量，TMT 通道数通常更高，iTRAQ 有经典 4-plex/8-plex 应用基础。选择时要看样本数、仪器平台、预算和分析目标。
3、iTRAQ 能做组织样品吗？
可以。它是体外肽段标记，不要求像 SILAC 那样在活细胞培养中代谢标记。组织样品更要注意提取一致性、批次平衡和生物学重复。
4、为什么 iTRAQ 的差异倍数有时偏小？
常见原因是共碎裂、共洗脱、样品复杂度高或分级不足，导致 reporter ion 比值被压缩。需要通过分级、质控和统计模型降低影响。
结论
iTRAQ 名字里同时出现 relative 和 absolute，但在常规蛋白组学服务中，它首先是多样品相对定量工具；只有在加入已知内标并设计校准体系时，才适合做特定目标的绝对定量。做项目时不要只看通道数，要同时看样品类型、重复设计、标记效率、分级深度和后续验证路线。
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