如何优化蛋白质印迹的抗体浓度？
每个蛋白质印迹实验都涉及在不同条件下与独特样品相互作用的独特抗体。没有一种抗体或抗原浓度适用于每个实验。为了获得最完美的蛋白质印迹，需要优化抗体浓度。理想的抗体浓度取决于抗原浓度、抗体的特异性和亲和力以及缓冲液组成等实验条件。次优抗体浓度会导致几个常见错误包括弱信号、非特异性条带以及斑点或斑点背景。优化抗体浓度可以解决这些问题以及更多问题，但执行多次蛋白质印迹以获得最佳浓度既耗时又浪费。一种更简单、更快捷、更便宜的方法是改用斑点印迹法。1、使用您选择的缓冲液制备一系列蛋白质样品稀释液，并制备抗体稀释液。2、将硝酸纤维素膜切成 1 厘米长的条状，足以用两个或三个二抗稀释液测试一或两个一抗稀释液。3、使用尽可能少的体积将您的样品点在硝酸纤维素膜条上。要点样大于 5ul 的样品，请在同一点多次点小体积，让每个点每次都完全干燥。打点完成后，让膜条干燥 10-15 分钟。4、通过在室温下浸泡在封闭缓冲液中 1-2 小时来封闭膜。使用振动筛确保覆盖均匀。5、应用一抗稀释液，在轨道振荡器上孵育 1 小时。接受相同浓度一抗的条带可以在同一浴槽中一起孵育。6、在洗涤缓冲液中彻底清洗膜条。以与以前相同的方式应用二抗稀释液。7、再次清洗膜条，如第 6 步。8、根据您正在使用的基材的数据表中的说明，准备基材工作溶液。9、将硝酸纤维素条与底物工作溶液一起孵育 5 分钟，或直到出现颜色。10、使用化学发光底物时，观察结果或用胶片或相机成像。最佳蛋白质浓度会产生黑点或持续 5-20 小时的强化学发光信号。
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