BTP项目文章 | 驴和人初乳以及成熟乳中的乳脂球膜蛋白质的特定位点N-糖基化表征和比较
2023年5月，沈阳市北方战区总医院和沈阳农业大学合作在食品科技一区Top期刊Food Chemistry（IF=8.8）上发表了题为”Characterization and comparison site-specific N-glycosylation profiling of mature milk fat globule membrane proteome in donkey and human colostrum and milk”的研究论文。本研究旨在通过位点特异性糖蛋白质组学研究策略，系统表征驴乳和人乳乳脂球膜（MFGM）糖蛋白的位点特异性N-糖基化表达图谱。结果发现驴初乳（DC）、驴成熟乳（DM）、人初乳（HC）和人成熟乳（HM）中存在大量的位点特异性N-糖链，揭示了驴乳和人乳MFGM N-糖蛋白的组成差异以及在泌乳期间驴乳和人乳MFGM糖蛋白位点特异性N-糖基化的动态变化。
研究背景
母乳对于新生儿的头六个月或更长时间的健康饮食至关重要。然而，全球仅有36%的婴儿在六个月内完全由母乳喂养，国内更低，仅有21%，从而导致婴儿配方奶粉市场蓬勃发展。市面上常见的以牛乳为基础的奶粉存在牛乳蛋白过敏、消化不良和易患肠道炎症等风险，因此，开发其他奶源的婴儿配方奶粉以缩小与母乳在营养成分方面的差距非常重要。
驴乳在生化成分和感官特性上与人乳相似，且富含生物活性和抗感染因子，能够支持新生儿的健康代谢和正常生理功能。因此，驴乳被认为是可以直接取代婴儿配方奶粉中蛋白质来源的理想选择。此外，相较于人乳，驴乳的乳脂球（MFG）更小，小尺寸的乳脂球有助于更多的乳脂球膜（MFGM）被吸收。在哺乳过程中，含有三酰甘油核心的MFG通过分泌从乳腺上皮的顶端释放，并被顶端质膜所包裹。MFGM不仅稳定了MFG结构，还在改善新生儿的肠道构造、肠道黏膜屏障和神经认知发育方面发挥着重要作用。MFGM蛋白占乳蛋白总量的1% - 4%，对新生儿的各种细胞过程和免疫防御机制具有重要作用。驴MFGM蛋白含有947种蛋白，参与了先天免疫反应、细胞凋亡和细胞间粘附等生物过程。
作为膜蛋白，MFGM蛋白的表面具有丰富的糖基化修饰。其中，N-糖基化是最丰富且最常见的翻译后修饰，不仅调控蛋白质折叠系统以改善蛋白质的生物物理性质，还能增强蛋白质底物的生物活性，如益生元、免疫调节和抗病原性等。近年来，位点特异性糖蛋白组学技术的迅猛发展已成为研究糖蛋白中肽段序列以及与之相连的糖链结构的主要策略。
在本研究中，位点特异性糖蛋白组学分析、N-糖基化的全局分析、N-糖蛋白的GO功能注释分析、糖蛋白核心与分支结构比较、N-糖蛋白的鉴定，均由百泰派克生物科技提供服务。百泰派克生物科技开发了一系列稳定高效的液相色谱高分辨质谱 (LC-MS/MS)表征方法，涵盖了从糖链分析，到糖基化位点鉴定（N糖基化位点和O糖基化位点分析），再到糖肽解析到完整分析流程。
主要研究内容及结果
本研究主要采用位点特异性糖蛋白组学技术，对驴初乳（DC）、驴成熟乳（DM）、人初乳（HC）以及人成熟乳（HM）的乳脂球膜蛋白（MFGM）进行了位点特异性N-糖基化图谱的绘制。研究揭示了这四种MFGM蛋白在总体和微观层面的差异，通过生物信息学分析，进一步探究了DC、DM、HC和HM的MFGM蛋白N-糖核心以及分支结构之间的关系，以及这些结构对多种生物过程的影响。这项研究将有助于更深入地理解驴和人乳MFGM蛋白的糖基化结构和功能，为未来的研究提供了更深入的方向。
1.驴和人乳MFGM蛋白的位点特异性糖蛋白质组学分析
图1 DC、DM、HC和HM MFGM蛋白的位点特异性糖蛋白质组学分析
图中呈现了通过位点特异性糖蛋白质组学研究方法，对DC、DM、HC和HM样本的N-糖蛋白、N-糖基化位点以及N-糖链分布进行系统性的表征。同时，图中还包括了四种样本中共有和独有的糖蛋白与N-糖链的分析结果。研究数据显示，在初乳（DC、HC）中相较于成熟乳（DM、HM），能够鉴定出更多的N-糖蛋白以及位点特异性N-糖链。这可能有助于与病原微生物及其毒素竞争性地与新生哺乳动物肠上皮细胞表面的聚糖受体结合，从而避免肠道感染。
2.哺乳期间驴和人乳MFGM糖蛋白N-糖基化修饰的全局分析
图2 驴和人乳中MFGM N-糖蛋白的N-糖位点以及位点特异性N-聚糖分析
图2A展示了各样本中N-糖蛋白数量随着糖蛋白上N-糖基化位点数量的增加而减少的宏观异质性。图2B体现了样本中随着N-糖基化位点携带N-糖链的数量增加，对应N-糖基化位点数量先减少后增加的趋势。研究也观测到一些位点携带大量位点特异性的N-糖链，如在驴乳MFGM糖蛋白中，来自DC的乳转铁蛋白N502位点携带58种N-糖链；在人乳MFGM糖蛋白中，来自HC的乳粘蛋白N238位点携带了137种N-糖链。图2C根据糖链组成对N-糖链种类进行了分类，并统计了不同种类N-糖链的丰度情况。其中值得注意的是，人和驴乳MFGM糖蛋白上均存在大量的唾液酸或岩藻糖修饰，唾液酸与岩藻糖基化对新生哺乳动物的视网膜发育、肠道菌群形成、免疫系统改善、大脑发育和认知功能等过程具有极为积极的生物作用，本研究也揭示了这两种糖基化类型在乳汁中高表达的重要性。N-糖链根据核心岩藻糖与平分型乙酰葡萄糖胺的存在与否可以分类为四种核心结构，图2D展示了各样本中鉴定到的N-糖链的核心结构分布。人乳MFGM糖蛋白HC与HM的N-糖链的核心结构分布较为接近，并且相较于驴乳拥有更高的核心岩藻糖修饰。在驴乳MFGM糖蛋白中DM的核心岩藻糖修饰水平相较于DC则更低。N-糖链结构的丰富性与复杂性也表现在分支结构的类型。图2E对样本中鉴定到糖链的所有分支结构进行了汇总与比较，数据显示人与驴乳MFGM糖蛋白主要分支结构包括甘露糖、LacNAc、GlcNAc、Lewis与末端唾液酸等分支类型。该数据还直观地展示了样本中所有分支类型的占比以及不同样本中分支类型的丰度差异。
3.驴和人乳中MFGM N-糖蛋白的GO功能注释分析
图3. DC（A）、DM（B）、HC（C）和HM（D）中MFGM N-糖蛋白的GO分析
对所有鉴定出的蛋白进行GO功能注释分析后发现，DC、DM、HC和HM MFGM糖蛋白主要参与细胞粘附，且其主要定位于内质网、细胞表面、细胞外空间以及质膜。另外，DC、HC和HM的MFGM糖蛋白与整合素和肌动蛋白结合；而DC、DM和HM的MFGM糖蛋白具有肝素结合特性。此外，DC、DM和HC的MFGM糖蛋白也具有钙结合特性。不仅如此，DC、DM、HC和HM的MFGM糖蛋白在吞噬体、补体和凝血级联通路中都有参与，其中吞噬体在DC、DM、HC和HM MFGM糖蛋白相关的KEGG通路中排名第三。吞噬作用是一种先天防御机制，吞噬细胞和中性粒细胞等细胞吞噬和追捕各种病原体，以应对病原体感染。因此，大量富集在吞噬体中的MFGM糖蛋白表明了它们在新生哺乳动物的生理过程中具有重要作用。
4.驴和人初乳中特异性MFGM糖蛋白核心与分支结构比较
图4. 与不同生物过程相关的DC和HC特异性MFGM糖蛋白核心与分支结构比较
接下来，研究人员根据BP分析的结果，对涉及不同生物过程的人和驴初乳MFGM糖蛋白的核心结构与分支结构进行了对比。研究发现，这些糖蛋白在人和驴初乳中表现出不同的特异性表达，并参与了不同的生物学过程。如图4所示，在DC特异性MFGM糖蛋白中，具有五糖核心、甘露糖分支和GlcNAc分支结构的蛋白主要参与细胞粘附、整合素介导的信号通路以及靶向溶酶体的过程。而HC中的Lewis分支结构主要在抗原加工和呈递等生物过程中表达，同时唾液酸化的LacNAc在抗原加工和呈递相关的过程中也显示出高水平的表达。这些结果表明，MFGM糖蛋白在不同生物过程中具有不同的核心和分支结构，并且在理解和调控乳中糖蛋白功能方面具有重要意义。
5.初乳与成熟乳中特异性MFGM糖蛋白核心与分支结构比较
图5. 与不同生物过程相关的DC和DM特异性MFGM糖蛋白核心与分支结构比较
紧接着，研究人员进一步对人和驴初乳以及成熟乳中涉及不同生物过程的MFGM糖蛋白的核心与分支结构进行了比较。图5呈现的结果显示，在驴乳中，DC特异性的MFGM糖蛋白具有五糖核心和甘露糖分支结构的蛋白主要参与细胞粘附、溶酶体靶向蛋白、溶酶体组织和整合素介导的信号通路等生物过程。DM特异性的糖蛋白中，具有五糖核心和带有或不带有唾液酸化的LacNAc分支结构的蛋白主要涉及嘧啶核苷转运、嘌呤核苷跨膜转运和核苷跨膜转运等生物过程。在人乳中，HC特异性MFGM糖蛋白具有五糖核心结构，同时还包含甘露糖和LacNAc分支结构的蛋白主要在病毒进入宿主细胞、血管生成正调节和蛋白激酶B信号正调节等通路中发挥作用。而在人成熟乳（HM）中，特异性MFGM糖蛋白具有五糖核心结构，并伴随着甘露糖、Lewis和GlcNAc分支结构的蛋白，主要参与蛋白质分泌、蛋白质转运、低密度脂蛋白颗粒清除以及胆固醇稳态的正向调节等生物过程。
6.驴和人乳中共有的MFGM N-糖蛋白表征
图6. DC、DM、HC、HM共有的MFGM N-糖蛋白表征
在此研究中，借助完整糖肽为基础的糖蛋白质组学技术，对泌乳期驴乳和人乳中的MFGM糖蛋白进行了全面研究。研究团队鉴定了12种在DC、DM、HC和HM中共同存在的MFGM糖蛋白，其中包括亲丁基蛋白亚家族1成员A1、白细胞表面抗原CD47、血小板糖蛋白4、乳转铁蛋白、黏蛋白4等。功能分析表明，在驴乳中共有的MFGM糖蛋白主要参与细胞增殖的正调控和基因表达的负调控等生物过程；而在人乳中共有的MFGM糖蛋白则主要富集于天然免疫应答、细胞增殖的正调控以及细胞凋亡过程的负调控等生物过程中。KEGG通路分析显示，驴和人乳中共有的MFGM糖蛋白与AMPK信号通路和ECM-受体相互作用通路相关。
对于糖链结构的修饰，研究发现核心结构存在与否主要与核心岩藻糖的存在相关。相较于驴乳，人乳中核心岩藻糖修饰水平更高，尤其在DM中，大部分核心结构为核心五糖结构。在驴乳中，更常见的是甘露糖和单一GlcNAc分支这类简单的分支结构，而在人乳中，复杂分支如Lewis类和存在或不存在唾液酸修饰的LacNAc分支则更为丰富。
综上所述，本研究通过完整糖肽为基础的糖蛋白质组学技术，全面地研究了泌乳期的驴乳和人乳中的MFGM糖蛋白。研究不仅鉴定了多种N-糖蛋白，还详细描述了它们的位点特异性N-糖基化谱。通过GO注释和KEGG通路分析，揭示了不同MFGM糖蛋白的生物活性与N-糖基化之间的关系，为N-糖结构和生物功能提供了重要信息。此外，研究为糖基化调节人类健康生理学提供了新的视角，并为进一步开发类似于人乳的驴乳婴儿配方奶粉提供了技术支持。
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