如何通过LC-MS/MS实现高通量Shotgun蛋白质鉴定？

要实现高通量的 Shotgun蛋白质鉴定，LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱） 是目前最主流、最有效的策略之一。它能够在复杂样本中快速解析数千种蛋白质，广泛应用于基础研究、疾病机制解析、药物靶点发现等领域。

 

一、什么是Shotgun蛋白质组学？

Shotgun蛋白质组学，又称为“底物导向法（bottom-up proteomics）”，是一种先将蛋白质酶解为多肽，再进行质谱分析的方法。这种方法能够避免直接分析完整蛋白质所面临的困难，特别适用于复杂生物样本中大规模蛋白质鉴定与定量。

 

二、LC-MS/MS在Shotgun蛋白质鉴定中的作用

1、液相色谱（LC）实现肽段的分离

酶解后的多肽混合物复杂度极高，直接进入质谱会导致信号重叠、识别效率低。因此，LC部分的任务是将这些多肽在保留时间上尽可能分开，常用的系统包括：

（1）纳升流反相液相色谱（nano-RPLC）

（2）高pH反相预分级系统

优化的分离策略可以显著提升低丰度肽段的检测概率，从而提高整体蛋白质覆盖度。

 

2、串联质谱（MS/MS）实现肽段的定序与定量

LC分离后，多肽依次进入质谱仪，经历以下流程：

（1）MS1（一级质谱）：检测所有肽段的母离子质量与丰度；

（2）MS2（碎裂谱图）：选取部分母离子进行碎裂，获取肽段结构信息（序列）；

（3）数据库检索：将获得的MS/MS谱图与已知蛋白数据库匹配，完成蛋白质鉴定。

目前主流质谱平台包括 Orbitrap、Q Exactive、TIMS-TOF 等，在高分辨率与高速扫描能力方面表现优越，适合大规模高通量分析。

 

三、实现高通量Shotgun蛋白质鉴定的关键策略

1、样本前处理的标准化与自动化

高通量的第一步是样本处理流程的可复制性与稳定性。关键包括：

（1）蛋白抽提的一致性（避免批次间偏差）；

（2）酶解效率的优化（如FASP、S-Trap等快速酶解技术）；

（3）引入自动化平台（如KingFisher、AssayMAP）可提升通量并减少人工误差。

 

2、多维分离策略提升肽段覆盖率

单一维度的LC分离很难覆盖全部蛋白质组。常见多维策略包括：

（1）在线2D-LC（高pH × 低pH反相）；

（2）离线高pH分级结合DDA/DIA分析。

通过增加样本复杂度的“降维”处理，提升低丰度肽段的检测能力，从而增加整体鉴定数量。

 

3、数据采集模式优化：DDA vs DIA

（1）DDA（Data-Dependent Acquisition）：

• 常规方式，基于MS1强度选择母离子进行碎裂；

• 易受低丰度信号干扰，重复性较低。

（2）DIA（Data-Independent Acquisition）：

• 将所有母离子按窗口平均碎裂，全面无偏采集；

• 配合谱图库使用，适合高通量重复性实验。

在百泰派克生物科技，我们结合最新的DIA-NN与Spectronaut算法平台，为大规模蛋白质样本提供高重现性、低缺失值的数据获取方案。

 

4、高性能质谱平台选择

质谱系统的性能决定了检测深度与通量。推荐配置：



百泰派克生物科技已全面布局主流质谱平台，支持多类型样本的定制化Shotgun蛋白质鉴定。

 

四、数据处理与生物信息学分析

完成蛋白鉴定后，仍需强大的生信支持，转化为有生物学意义的结论：

1、定量分析：LFQ、iBAQ、TMT等；

2、功能注释：GO/KEGG通路富集、蛋白互作网络；

3、差异分析：统计筛选差异蛋白，挖掘潜在生物标志物。

百泰派克生物科技提供一站式数据分析服务，涵盖从原始数据质控到可视化图表生成，助力科研人员高效发表成果。

 

通过优化样本处理流程、引入多维分离策略、选择合适的数据采集模式与高性能质谱平台，LC-MS/MS技术能够高效完成Shotgun蛋白质鉴定，满足高通量生命科学研究的需求。百泰派克生物科技专注于蛋白组学与多组学平台构建，已为数百家高校与企业提供高质量质谱服务。如您正计划开展大规模蛋白质组学项目，欢迎联系我们获取免费方案评估与定制化服务建议。

 

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