如何用DDA模式执行定性Shotgun蛋白质鉴定？
- 高深度的Shotgun蛋白质鉴定服务（>7000个蛋白/样本）
- 个性化参数优化（根据样品特性调整TopN、碎裂能等）
- 支持磷酸化、乙酰化等多种修饰分析
- 提供中英文数据报告和科研图表支持
在生命科学研究中，蛋白质是连接基因组信息与细胞功能的核心桥梁。为了系统识别和分析生物样品中的全部蛋白质，Shotgun蛋白质鉴定成为目前应用最广泛的策略之一。该方法通过酶解后的肽段混合物直接进入质谱系统，结合DDA（Data-Dependent Acquisition）模式进行高通量采集，适用于复杂样本的全面筛查。无论是在疾病机制研究、标志物发现，还是药物靶点挖掘中，精准、高覆盖率的蛋白鉴定能力都是科研成功的关键。本文将系统介绍如何基于DDA模式开展Shotgun蛋白质鉴定，并结合实验策略和数据分析要点，助力科研人员高效获取深度蛋白组信息。
一、什么是DDA模式？
DDA（数据依赖采集）是一种基于MS1（一级质谱）强度触发MS/MS（MS2）扫描的采集模式。在DDA中，质谱仪首先对样品进行MS1全扫描，并选择强度最高的前N个母离子（通常是10~20个）进行碎裂（MS2扫描），再进入下一轮MS1采集。这一模式特别适用于复杂蛋白样品的广谱筛查，例如细胞裂解液、组织提取物等，适合进行Shotgun（散弹枪式）蛋白质组学分析，也被称为DDA模式下的 Shotgun蛋白质鉴定。
二、DDA模式下的Shotgun蛋白质鉴定流程
以下是开展DDA-Shotgun实验的典型步骤：
1、蛋白样品准备
（1）样品类型：细胞、组织、血清等复杂混合物
（2）蛋白提取：RIPA或SDS裂解，配合超声或匀浆
（3）定量：BCA、Bradford方法
（4）酶解：Trypsin酶解（一般酶解12~16小时，37°C）
（5）脱盐：用C18柱去除盐离子和杂质，提升质谱灵敏度
2、液相色谱分离（LC）
（1）使用高效纳升级反相色谱柱（如C18）
（2）梯度洗脱时间通常为60~120分钟
（3）保证肽段的充分分离，减小共洗脱现象
3、质谱采集设置（MS）
常用质谱平台如：Thermo Orbitrap系列（Fusion、Exploris、QE Plus等）、SCIEX TripleTOF系列、Bruker timsTOF。
三、DDA的优劣势分析
1、优势
（1）对高丰度蛋白鉴定效果优秀
（2）技术成熟，文献广泛
（3）软件支持丰富（如MaxQuant、Proteome Discoverer）
2、局限性
（1）低丰度肽段易被忽略（由于“TopN”机制）
（2）重复性略逊于DIA（数据独立采集）
（3）扫描效率受限，信息有“丢失风险”
因此，在开展Shotgun蛋白质鉴定时，选择合适的TopN策略和仪器设置至关重要。
四、数据分析与蛋白质鉴定
DDA数据的解析依赖于数据库搜索引擎，常用工具包括：
1、MaxQuant + Andromeda
（1）支持标签和无标签定量
（2）可整合LFQ、iBAQ等定量方法
（3）强大的修改位点识别功能
2、Proteome Discoverer + Sequest HT
（1）灵活的工作流搭建
（2）与Thermo平台无缝集成
（3）可接入Percolator优化打分
3、搜索数据库建议
（1）使用Uniprot或RefSeq数据库
（2）保证物种匹配、去冗余、包含污染库（contaminants）
4、鉴定标准
（1）FDR（假发现率）控制在1%
（2）至少包含1条唯一肽段
（3）建议结合肽段覆盖率、质谱图手动验证
这些分析策略均是实现高通量Shotgun蛋白质鉴定的关键步骤。
五、提升DDA定性效果的策略
1、样品预分级：通过高pH反相分级可显著提高鉴定通量
2、动态排除优化：设置合理的排除时间，避免重复采集
3、增强富集：对于特定研究，如磷酸化蛋白，可引入IMAC或TiO₂富集步骤
4、仪器校准与维护：保持离子源状态稳定，定期清洗提升信号质量
以上策略不仅适用于DDA模式，也能广泛提升Shotgun蛋白质鉴定的整体深度和覆盖率。
六、百泰派克生物科技的质谱平台优势
在百泰派克生物科技，我们构建了以Orbitrap Exploris 480 + FAIMS Pro + nanoLC为核心的蛋白质组学平台，专注提供：
我们已为数百家科研单位和生物医药企业提供定制化蛋白质组学服务，助力基础研究与转化医学。
尽管近年来DIA和PRM等新技术日益兴起，但DDA仍以其成熟度、数据质量和广泛适用性，被广泛用于基础科学和生物医药研究。掌握DDA模式下的Shotgun蛋白质鉴定策略，是开启蛋白质组学研究之门的关键一步。如果你正在规划蛋白质组学实验，欢迎咨询百泰派克生物科技，我们将根据研究目标和样品特点，为您量身定制最合适的质谱解决方案。
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