请问有S-亚硝基化分析的protocol吗？

以下是一份简化的S-亚硝基化蛋白分析protocol：

 

材料和试剂

• 目标蛋白质样品
• 缓冲溶液，例如PBS（磷酸盐缓冲盐水）
• 蛋白质提取试剂
• 蛋白质浓度测定试剂，例如BCA蛋白定量试剂盒
• 还原剂，如DL-二硫苏糖醇（DTT）
• 烷基化剂，如碘乙酰胺（IAM）
• 胰蛋白酶或其他蛋白酶
• 质谱仪（例如LC-MS/MS）
• 质谱分析软件（如Mascot、SEQUEST或MaxQuant）

 

实验步骤：



1.样本准备：

• 使用蛋白质提取试剂提取S-亚硝基化蛋白，并通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。
• 用PBS缓冲溶液稀释蛋白质样品至所需浓度。

 

2.蛋白质还原和烷基化：

• 将DTT加入蛋白质样品中进行还原反应。
• 随后用IAM进行烷基化反应，封闭还原后的硫醇基团。

 

3.酶解：

将处理后的蛋白样品用胰蛋白酶进行消化，通常在37°C下进行4-6小时或过夜。

 

4.质谱分析：

• 使用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）对酶解后的肽段进行分离和分析。
• 识别肽段并鉴定S-亚硝基化位点。

 

5.数据处理：

• 用质谱数据分析软件处理数据，鉴定S-亚硝基化位点。

 

注意事项：

• 避免样品在实验过程中被非特异性脱亚硝基化。
• 酶解效率对于质谱分析结果至关重要，应优化酶解条件以确保充分酶解。
• 确保使用的IAM浓度足够以达到完全烷基化，防止硫醇基团在分析过程中再次形成。
• 分析软件的参数设定应针对S-亚硝基化修饰进行优化，以确保准确识别

 

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