在蛋白质谱切胶实验中，使用 ACN:NH₄HCO₃（1:1）溶液进行脱色时，最多可以持续多长时间？若需过夜处理，应如何储存？

在蛋白质谱切胶实验中，使用 ACN:NH₄HCO₃（1:1）溶液脱色（主要目的是去除考马斯亮蓝等染料，同时开始部分脱水）时，该步骤一般控制在30分钟到1小时内，并需反复更换溶液以确保充分脱色及凝胶脱水。不建议在室温下长期（数小时以上）浸泡，尤其是过夜处理，因为长时间暴露在含水缓冲体系里（即便有 50% ACN）会增加扩散丢失小肽段/小蛋白和化学修饰/水解风险，从而影响后续 MS 结果。

一、如需过夜，建议“过夜停在安全状态”，不建议“过夜脱色”

方案 A（最推荐）：脱色到位后，脱水并低温短期保存

1. 脱色完成后，用 100% ACN 脱水 5-10 min，胶粒会变白变硬。

2. 倒掉 ACN，让胶粒在洁净环境下真空抽干或短暂风干（几分钟，避免完全干成粉末状）。

3. -20°C 保存：

• 可将胶粒置于低蛋白吸附管中，干保存或加少量 100% ACN 覆盖后密封。

• 一般过夜到 1-2 天问题不大。后续继续流程时再用 NH₄HCO₃ 复水进入还原/烷基化/消化步骤。

优点：水少、温度低，蛋白/肽段扩散和降解风险最低；也不容易引入额外盐或污染。

方案 B（可选）：4°C 暂存于 50 mM NH₄HCO₃（不加 ACN 或低 ACN）

• 如果第二天马上做还原/烷基化/酶解，可以把已完成多轮脱色的胶粒放在 50 mM NH₄HCO₃（可含 ≤10% ACN）中短暂复水（10-15 min）后换新缓冲液，4°C 冷藏过夜。尽量避免反复冻融或室温长时间暴露。

• 但要注意：这是“权衡方案”，扩散丢失风险高于方案 A，尤其对低丰度/小分子量目标不友好。

不建议的做法

• 不建议在 ACN:NH₄HCO₃（1:1）里室温过夜脱色。

二、总结建议

1、脱色总时长控制在1-1.5小时内最佳，避免超过3小时。

2、若需过夜，建议“过夜停在安全状态”，不建议“过夜脱色”，首选方案A。

3、后续恢复常温后再进行还原、烷基化和胰蛋白酶酶解步骤。

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