为什么加了loading buffer并煮样后，放置于 -20°C保存，两天后上样时发现条带差异很大？

出现此类条带差异，主要可能涉及以下几个方面的因素，建议按顺序排查：

一、样本降解或蛋白聚集

1、加样缓冲液（loading buffer）和煮样是否充分？

如果煮样不彻底（如温度不足或时间太短），蛋白可能未充分变性，导致保存过程中聚集、沉淀或部分降解。

2、是否含有蛋白酶抑制剂？

常规 SDS loading buffer 不含蛋白酶抑制剂，若样本本身蛋白酶活性高，在-20°C下仍可能发生部分降解，特别是冰箱频繁开关造成温度波动时。

二、冻融循环对蛋白结构影响

冻存方式是否合理？

• 若反复冻融，或保存时未即时速冻（如液氮或-80°C速冻后转入-20°C），容易导致蛋白变性或析出。

• 某些蛋白在-20°C沉淀或部分不可逆聚集，影响条带完整性与迁移率。

三、SDS变性条件变化

1、SDS 可随时间析出或失活，特别是反复冻融后，其与蛋白结合能力下降，导致蛋白迁移异常或条带分散。

2、检查 loading buffer 是否新鲜配置，是否加入 β-ME 或 DTT，并在使用前充分混匀。

四、上样量与浓度不均一

保存后离心是否充足？

冷冻后上样前如未充分混匀或离心，易导致上样时取样不均，表现为条带强度或清晰度差异大。

五、建议

1、样本煮样后立即分装、速冻（液氮或 -80°C）保存，避免在-20°C长时间保存。

2、上样前先短时间高速离心并充分混匀。

3、视样本类型考虑在煮样前或buffer中加入蛋白酶抑制剂。

4、避免冻融循环。

5、尽量在煮样后当日上样，或采用原液冻存，临用前再加buffer煮样。

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