请问多肽蛋白样品的质谱怎么处理？

多肽/蛋白样品的质谱分析通常指通过蛋白质酶解生成肽段后，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定或定量。以下为标准处理流程，适用于细胞、组织或体液类样品的通用方案：

一、样品前处理（Sample Preparation）

1、裂解与蛋白提取

使用裂解液（含变性剂如8 M尿素或SDS）破碎样本，提取总蛋白。含磷酸酶/蛋白酶抑制剂以防降解。

2、蛋白定量

推荐使用BCA法，保证入量一致性（通常100–200 μg用于后续处理）。

二、还原与烷基化（Reduction and Alkylation）

1、还原

DTT或TCEP处理，断开二硫键（常用浓度10 mM，37°C，30–60 min）。

2、烷基化

IAA封闭巯基，防止重组二硫键（常用浓度20–40 mM，避光，30 min）。

三、蛋白酶解（Protein Digestion）

常用胰蛋白酶（Trypsin），酶：底物 = 1:50~1:100，37°C孵育12–16 h。高盐/高变性剂条件建议采用FASP法，提高酶解效率并去除干扰物。

四、肽段纯化与脱盐（Desalting）

采用C18小柱或StageTip进行脱盐，去除缓冲盐、变性剂等，避免干扰离子抑制。

五、上机分析（LC-MS/MS）

1、液相色谱

使用反相纳米流液相分离肽段，梯度洗脱。

2、质谱采集模式：根据目的选择：

• DDA：用于深度鉴定，建立谱库。

• DIA：用于高通量定量分析。

• TMT标记：适用于多样本定量比较。

• 无标记定量：适用于大批样本或资源有限场景。

六、数据分析

1、DDA数据：常用数据库搜索工具如MaxQuant、Proteome Discoverer。

2、DIA数据：常用Spectronaut、DIA-NN等软件。

3、定量分析：可结合R/Python工具进行统计学与功能富集分析。

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