氨基酸分析法的蛋白含量测定具体的操作是什么？

氨基酸分析法测定蛋白含量的核心原理是：将样品中的蛋白质完全水解为游离氨基酸，然后通过氨基酸分析仪测定各氨基酸的摩尔含量，进而根据氨基酸组成和理论分子量换算出蛋白含量。该方法属于绝对定量，常用于标准品定值或参考分析。以下为标准操作流程：

一、样品准备

1、样品类型：粉末、冻干物、组织匀浆或蛋白溶液均可。

2、蛋白质含量范围：一般推荐每个样本含蛋白量 ≥50 µg，视仪器灵敏度和目标分析氨基酸而定。

3、脱盐：若样品中含高盐、缓冲液或干扰物，建议透析或固相萃取去除。

二、酸水解（通常为酸性水解法）

目的：将蛋白质彻底裂解为氨基酸单体。

1、水解条件：

• 6 mol/L HCl（或HCl/0.1% phenol，防止Trp氧化）。

• 110 °C，24小时，密封真空氮气中（防止氧化）。

2、样品管要求：真空氢化石英安瓿或PTFE密封管，确保水解过程中密闭、耐酸。

3、注意事项：

• Trp易降解，需碱性水解另测。

• Ser、Thr、Cys部分易降解或修饰，定量需修正因子。

• 氧化型Met也可能低估，必要时加抗氧化剂处理。

三、氨基酸衍生化（可选）

若使用前柱衍生法（如PITC、OPA等）：

• 水解后干燥样品。

• 使用衍生试剂衍生化游离氨基酸，提高检测灵敏度和分离效果。

四、氨基酸分析仪检测

采用离子交换柱+梯度洗脱+紫外或荧光检测。

1、常用设备：如L-8900（Hitachi），Biochrom 30等。

2、检测方式：

• 柱前衍生（如PITC，检测波长254 nm）。

• 柱后衍生（如ninhydrin显色，检测波长570 nm和440 nm）。

3、根据每种氨基酸的保留时间和峰面积进行定量。

五、蛋白含量换算

以某些不易降解氨基酸的摩尔量为基准，结合理论氨基酸组成回算蛋白质含量。

• 一般选择：Leu、Ile、Phe、Val、Lys等稳定氨基酸。

• 若目标蛋白氨基酸序列已知：可用平均残基分子量（约110 Da）计算总蛋白量。

• 若未知蛋白序列：可使用标准曲线或外标法进行估算。

六、质量控制建议

• 设置水解空白、已知量蛋白标准品（如BSA）作为阳性对照。

• 所得氨基酸总摩尔数应与理论蛋白组成一致（差异在±10%内）。

• 注意Trp和Cys结果是否缺失，如需定量，需独立处理。

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