WB蛋白加了loading70℃煮了七八分钟还能用吗？
可以的。70 °C加上loading buffer煮7–8 分钟属于常见的预变性条件，对大多数WB靶标不会造成问题，完全可以上胶/转膜继续做。但可能存在变性不完全的风险。如目标蛋白结构复杂、分子量较大或对结果要求较高，建议重新取样进行变性处理以确保实验可靠性。
还需留意以下几种情况：
1. 易聚集或高分子量/膜蛋白：过热会促发疏水聚集；若后面出现弥散或跑不进胶，下次可改为50–60 °C 10 min，或70 °C 5–10 min即可，通常比95 °C更稳。
2. 构象/磷酸化敏感表位：少数抗体识别构象相关表位，强热可能削弱信号；务必加足蛋白酶/磷酸酶抑制剂，并避免过度加热。
3. 含尿素的缓冲液（不常见于标准Laemmli）：≥60–70 °C易发生氨甲酰化，建议低温短时处理。
现在怎么补救/检查
1. 轻轻涡旋后短暂离心，若有沉淀，取上清上样即可。
2. 不放心就先跑一条小试道或做Ponceau检查转膜上总蛋白条带是否正常。
下次更稳妥的建议
1. 经验参数：70 °C 10 min或95 °C 3–5 min；膜蛋白/超大蛋白用50–60 °C 10 min更安全。
2. 还可在样品里确保2% SDS + 50–100 mM DTT/5% β-ME，并避免反复冻融。
加了loading在 70 °C 煮了7–8 min的蛋白可以继续使用；若出现条带异常，再按上面思路微调条件即可。
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