如何对c57新生胎鼠粪便胆汁酸谱的成分和含量进行胆汁酸定性和定量检测呢？

要对C57新生胎鼠粪便中的胆汁酸谱进行定性和定量分析，需解决以下关键技术点：样本基质复杂、胆汁酸种类多且极性差异大、含量可能极低。以下是推荐的实验流程与方法：

 

一、样本预处理

1、粪便收集

（1）收集时间：确保新生鼠肠道首次排泄后及时采集，避免污染母源成分。

（2）保存方式：立即在液氮中速冻，-80°C长期保存，避免胆汁酸降解。

 

2、胆汁酸提取

（1）称量样本：精确称取10–50 mg冻干后粪便。

（2）提取溶剂：加入预冷的70%甲醇（含0.1%甲酸）或75%乙腈/水，体积比1:20~1:40。

（3）内标添加：加入稳定同位素标记的胆汁酸内标（如d4-CA、d4-CDCA、d4-DCA等），用于后续定量。

（4）超声震荡 + 涡旋混匀：冰浴超声15–30分钟，4°C离心。

（5）取上清过滤：0.22 μm滤膜处理，转移至进样瓶。

 

二、色谱-质谱平台选择

建议使用UPLC-MS/MS平台，配合MRM模式进行高灵敏定量分析。

1、色谱条件（推荐）

（1）色谱柱：C18反相柱（如 Waters Acquity UPLC BEH C18, 1.7 μm, 2.1×100 mm）

（2）流动相：

• A：0.1%甲酸水溶液

• B：0.1%甲酸乙腈

（3）梯度洗脱：设定适合胆汁酸分离的梯度（如30 min内从20% B升至95% B）

（4）流速：0.3 mL/min

（5）柱温：40°C

（6）进样量：5 μL

 

2、质谱条件（以三重四极杆为例）

（1）电离方式：负离子模式（ESI-）

（2）监测方式：MRM（多反应监测）

（3）参数优化：对每种胆汁酸（包括结合型与游离型）优化碎裂电压与碰撞能

 

三、数据处理与定量方式

1、标准品定量

• 使用市售胆汁酸标准品（如Sigma或Cayman）建立浓度梯度标准曲线。

• 每种胆汁酸应设立独立定量通道，结合内标校正基质效应与损失。

 

2、数据分析

• 使用MassLynx、Analyst或Xcalibur等软件提取MRM峰面积。

• 将未知样本峰面积与标准曲线对照，计算浓度（单位可为ng/mg粪便干重）。

 

四、可分析目标物

常见检测胆汁酸包括：

• 初级胆汁酸：CA（胆酸）、CDCA（鹅脱氧胆酸）

• 次级胆汁酸：DCA（脱氧胆酸）、LCA（石胆酸）、UDCA（熊去氧胆酸）

• 缀合型胆汁酸：TCA、GCA、TCDCA、GCDCA 等

 

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