请问从组织中提取的蛋白，没加缓冲液就冻在-80℃了，需要时直接拿出来在室温化开后加缓冲液煮沸嘛？

此操作存在较大风险，不建议直接使用。请参考以下分析：

 

一、问题本质分析

1、未加缓冲液直接冷冻

• 缺乏蛋白稳定剂（如甘油、EDTA、蛋白酶抑制剂等）保护；

• 冷冻过程中形成冰晶，极易造成细胞结构与蛋白结构的机械损伤；

• pH 未被控制，金属离子、内源酶等可能在冷冻前已经开始部分蛋白降解。

 

2、室温化开后再加缓冲液

• 蛋白已经暴露于不稳定环境下，升温过程中内源性蛋白酶活性快速恢复，极易加剧蛋白降解；

• 缓冲液的加入时间点太晚，难以阻止上述不利反应。

 

二、处理建议

1、如样品极为宝贵、仍希望尝试

• 尽量在冰上慢慢解冻，避免室温快速化冻；

• 解冻立即补加裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）并迅速煮沸变性，尽量减少蛋白酶活性窗口时间；

• 但此法仅适用于目标蛋白为耐高温、表达量高的稳态蛋白（如WB检测的housekeeping protein），对膜蛋白、酶类等结构敏感蛋白不可取。

 

2、如样本尚有其他批次、可重新制备

建议重新进行蛋白提取，组织匀浆后立即加含抑制剂的裂解缓冲液，确保提取全过程中蛋白稳定。

 

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