冻蛋白之前还没有加loading buffer，要怎么处理呢？

若样品在未加loading buffer的情况下已冷冻，后续处理需视冻存方式及样品状态而定。以下为推荐处理步骤：

 

1、样品复融

将冻存的蛋白样品在冰上缓慢复融，避免高温或剧烈震荡，防止蛋白进一步变性或聚集。

 

2、评估复融状态

观察是否出现明显沉淀或絮状物。如有沉淀，可轻微离心（如12,000 × g，4℃，5分钟）去除不溶物，只取上清。

 

3、补加Loading Buffer：

• 取适量上清，与适量5×或6× SDS loading buffer按比例（如1:4）混合。

• 若需进行还原条件SDS-PAGE，确保loading buffer中含DTT或β-mercaptoethanol。

 

4、煮样处理

在95℃加热5–10分钟，使蛋白充分变性。

 

5、后续上样检测

如有疑虑可先跑一小块gel评估蛋白完整性及是否适合Western blot等后续应用。

 

注意事项：

1、若原冻存条件较温和（如含甘油、Tris等缓冲液），通常影响不大；

2、若冻存液中为纯水或低盐环境，蛋白变性风险较高，建议先检测蛋白浓度和条带情况再决定是否继续使用。

 

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