鉴定藻类样品中糖肽的结构，如果不使用完整糖肽解析方法，用解离糖链的方法分别鉴定糖链、肽链和糖基化位点，样品如何处理呢？

若采用非完整糖肽解析策略，仅通过糖链释放与肽段分析结合的方法鉴定藻类样品中的糖肽结构，实验流程需系统设计以实现对糖链、肽链和糖基化位点的独立解析。具体样品处理建议如下：

 

一、样品总提取

藻类样品细胞壁坚硬，需优化前处理步骤以充分提取糖蛋白：

1、细胞破碎：推荐采用液氮研磨结合超声波或高压匀浆；

2、蛋白提取缓冲液：建议使用含有阴离子表面活性剂（如SDS）及蛋白酶抑制剂的裂解液，避免糖蛋白降解；

3、除杂处理：经三氯乙酸/丙酮沉淀或甲醇/氯仿沉淀以去除多糖和色素等杂质。

 

二、糖链释放（N-糖为例）

为分别分析糖链结构，可使用以下方式释放糖链：

1、N-糖释放：使用PNGase F酶（常规水解N-连接糖），处理前应脱盐并去除SDS，可用FASP或S-Trap平台；

2、O-糖释放：如需分析O-糖，可采用β-消除法（化学法），但该法可能破坏肽链；

3、糖链纯化：释放后糖链通过C18除肽、HILIC富集，再行LC-MS或MALDI-MS分析糖链结构。

 

三、肽链与糖基化位点分析

糖链释放后残留的肽段仍可用于蛋白鉴定及糖基化位点确定：

1、酶解处理：使用胰蛋白酶（Trypsin）酶解糖脱除后的糖蛋白；

2、富集方法：

• 使用TiO₂、HILIC、ZIC-HILIC等方式富集含有糖基化修饰的肽段；

• 结合LC-MS/MS进行位点级别鉴定；

3、位点判断：依据PNGase F水解后Asn→Asp的+0.984 Da质量差，以及脱糖前后谱图比对，定位N-糖基化位点。

 

四、数据分析建议

1、糖链结构：使用GlycoWorkbench、GlycoMod等进行糖链组成与结构预测；

2、肽段分析：MaxQuant、PEAKS等支持脱糖肽段的位点分析；

3、如需保留部分糖残基信息辅助定位，也可选用Endo H等部分切糖酶，仅保留糖芯Man-GlcNAc用于定位糖位点。

 

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