做WB时先煮了样,又加了loadingbuffer,就放冰箱了,等要用的时候再次加热的温度和时间都是多少呀?
在Western Blot (WB) 实验中,如果你的样品已经在加入loading buffer后放入冰箱保存,并且准备在后续使用时再次加热,正确的加热条件非常重要,以确保样品保持良好的质量,并且能够有效地在SDS-PAGE中分离。
一、重新加热的温度和时间建议
1、加热温度:通常加热至 95-100°C,这个温度有助于完全变性蛋白质并使其充分解链,便于后续的SDS-PAGE分析。
2、加热时间:建议加热 5-10分钟。加热过久或过高的温度可能会导致蛋白质降解或其他不必要的变化。
二、步骤
1、取出样品:从冰箱中取出样品,并轻轻摇晃或混匀,确保均匀。
2、加热:将样品放入水浴或加热板中,设置温度为 95-100°C,加热 5-10分钟。
(1)如果使用水浴,确保水浴温度准确。
(2)如果是加热板,确保容器不会过热并且均匀加热。
3、冷却:加热后,样品可以自然冷却至室温或稍微冰冷,以免影响接下来的上样。
三、注意事项
1、避免过热:如果加热时间过长或温度过高,蛋白质可能会发生聚集或降解。因此,控制加热时间和温度是关键。
2、样品的稳定性:如果样品存放过长时间(比如超过一天),可能会导致蛋白质降解或其他化学变化。建议尽量在短时间内使用,避免长时间存放。
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