请问WB没加loading放进-80可以保存多久？膜蛋白是不是不能煮样,难道每一次都要bca吗？
WB样品未加loading buffer放-80°C，短期（1-2周）可行，长期不推荐。膜蛋白一般不建议煮沸，可用低温孵育或温和裂解法。BCA蛋白定量建议每次都做，除非实验条件极其稳定。以下为详细解释：
一、WB（Western Blot）没加loading buffer放进-80°C可以保存多久？
1、短期（几天到几周）：如果样品是细胞裂解液或蛋白提取物，未加样品缓冲液（Loading Buffer）直接存放在 -80°C，通常可以保存 1-2周 而不会有明显降解。
2、长期（几个月以上）：蛋白可能会发生降解或变性，尤其是如果反复冻融。如果计划长期保存，建议：
（1）尽快加入SDS loading buffer 并煮沸（如实验设计允许）。
（2）加入蛋白酶抑制剂以减少降解。
（3）尽量避免反复冻融，可将样品分装成小份。
二、膜蛋白是否不能煮样？
1、膜蛋白（Membrane Proteins）通常不建议煮沸，因为：
（1）煮沸（95°C, 5 min）可能会导致某些膜蛋白聚集、变性或沉淀，影响电泳分离和转膜效率。
（2）许多膜蛋白的跨膜结构域对于高温不稳定，可能会影响抗体识别。
2、解决方案
（1）降低变性温度：一般可选择 37°C~55°C孵育 10-20 min，而非 95°C 高温变性。
（2）使用温和的变性方法：如不加DTT、β-巯基乙醇或不加SDS的缓冲液。
（3）选择合适的裂解方法：使用 NP-40、Triton X-100 等温和去垢剂提取，而非SDS裂解。
三、每次做WB都需要做BCA蛋白定量吗？
1、理论上是的，建议每次都做BCA定量。
2、例外情况：
（1）同一细胞系、同样的裂解方法、相同的实验条件，如果前几次实验结果稳定，可以不做BCA，而是通过WB条带强度来相对调整。
（2）如果蛋白样品保存时间较长或者浓度可能有变化（如冻融或不同批次提取），最好重新做BCA，确保上样量一致。
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