多肽组学样品制备
多肽组学是一门研究生物体内所有肽类分子的组成、结构和功能的学科。大量研究表明，对疾病相关的多肽组进行分析可以识别多肽生物标志物，为特定的恶性、慢性和传染性疾病提供特异的诊断和预后信息。多肽组学在生物标记物的发现等方面虽然具有很大潜力，但其样本制备（肽提取和富集/纯化）方面还存在不小的挑战，下面就样品制备方法进行讨论归纳。
多肽组学中样品制备可分为五种主要方法：酸或碱介导的蛋白质沉淀、酶解法、有机溶剂沉淀法、离心超滤法和固相萃取法。在某些情况下通过这些方法可以富集100倍至1000倍的多肽。
一、酸或碱介导的蛋白质沉淀
酸或碱介导的蛋白质沉淀以天然蛋白质为原料，经酸或碱水解，得到多肽。这类方法较古老，工艺简单，然而难以控制水解程度，容易将肽链继续水解为氨基酸，并且水解过程中，氨基酸受到较大破坏，影响肽的结构及功能，碱水解尤为突出。另外，水解过程中，所用酸或碱的浓度高，水解完后须除酸或除碱，是该工艺过程中的主要工序。
二、酶解法
蛋白质的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，产物主要是肽，反应条件温和、时间短、效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸原有构型，产品纯度高，产物易分离，是制备多肽的有效方法。酶水解蛋白质条件温和、安全性高、可控性强、可以规模化生产特定的肽，制备过程中也可用超声波或微波辅助提取。其中，酶的种类是影响活性肽生成的最主要因素。不同种类的蛋白酶具有不同的底物特异性和催化机制，其在同一蛋白质中裂解多肽链的特定位置时会释放出不同的氨基酸序列片段。
三、有机溶剂沉淀法
有机溶剂的沉淀原理是加入有机溶剂降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。此方法为多肽临床质谱研究较为常用方法，一般有机溶剂以甲醇、乙醇、乙腈为主。有时也会在有机溶剂中加入一定量的有机酸来提高沉淀效率。加入乙腈等有机溶剂后溶液中大分子蛋白质发生沉淀，而肽溶解在有机溶剂中，有时会形成共沉淀导致肽损失，需要辅助解离试剂进行增溶，提高肽的回收率。
图1. 有机溶剂沉淀法示意图
四、离心超滤法
超滤 (Ultrafiltration) 是一种膜过滤，通过压力或浓度梯度等力使料液通过半透膜进行分离。 超滤膜能够截留尺寸范围为1-1000kDa（MW）的分子，并允许盐和水等小分子通过。它已广泛应用于处理大分子样品，特别是蛋白质溶液的分离和纯化。此外与沉淀法相比，超滤法更为温和，避免了可能导致生物大分子失活的相变，且超滤可以在浓缩的同时完成溶质的脱盐。
离心超滤是目前应用最广泛的从高分子量蛋白质中提取多肽的方法，它利用离心力选择性地驱动低分子量分子通过半透性的大小排斥膜。有研究者利用这种方法处理血清样品进行质谱分析鉴定出了300多种独特的肽，质量精度< 2ppm。
图2. 离心超滤法示意图
五、固相萃取法（SPE）
固相萃取（SPE）基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程，可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。SPE是一种从生物样品中获取内源肽的有效方法，固体吸附剂材料的结构和表面性质在肽的提取中起着重要作用。根据不同固体吸附剂材料又可分为：
（1）凝胶过滤色谱（GFC/SEC）：是利用分子大小提取内源性肽的有效方法。
（2）固定化金属离子亲和色谱法（IMAC）：是一种新型高效色谱分离模式，已经被广泛应用于蛋白质的分离分析。IMAC常作为捕获/释放柱，富集某一类肽段或蛋白质，以及含有组氨酸标签的重组蛋白的分离纯化。
（3）纳米材料磁珠富集法：磁珠（Magnetic Beads，MB）是由具有超顺磁性巧金属氧化物 与高分子有机物或无机材料相互作用形成的一种颗粒，可高度分散在载液（极性溶剂或非极性溶剂 ）中形成的稳定胶体溶液，固相萃取法中使用的纳米磁珠也可以通过优化其物理化学性质(孔径、孔结构和表面亲和力)来选择性地富集低分子量、低丰度的蛋白质和肽，包括具有特定性质的蛋白质和多肽。
图3. 纳米材料磁珠富集法示意图
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