泛素化怎么检测

与磷酸化、甲基化以及乙酰化修饰所添加的单一基团不同，泛素化修饰中的泛素（Ub）是一种广泛存在于真核细胞的由76个氨基酸组成、序列高度保守的小分子蛋白质，其空间结构由5个β折叠和1个α螺旋组成，形成SSHSSS结构。泛素化修饰指在E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的级联酶促反应下，泛素分子共价修饰到底物蛋白质赖氨酸侧链的ε氨基上，或者进一步共价连接到泛素分子的赖氨酸残基上，行使不同泛素链的组装过程。

图1 泛素化修饰过程

蛋白质上修饰的泛素分子除了作为蛋白质特异性降解的信号外，近年的研究发现，不同类型泛素链信号广泛参与目的蛋白质的细胞定位、调节蛋白质的稳定性、与相互作用蛋白结合和传递刺激信号等生物学功能，进而调控细胞内基因转录、信号传导、DNA 损伤修复、细胞周期调控、应激反应甚至个体的免疫应答等几乎所有的生命活动过程。

图2 不同泛素链介导的生物学功能

质谱是近年来生物学研究中一种常见的分析技术，目前被广泛用于蛋白质的检测。运用质谱技术检测泛素化蛋白的技术流程包括：样品制备、泛素化肽段的富集、生物质谱鉴定和数据分析等4个步骤。

• 样品制备：通常采用溶液或者胶内酶切的方法。利用位点特异性蛋白酶对提取的蛋白质混合液充分酶解。

• 泛素化肽段的富集：使用具有高亲和力的抗泛素抗体，将其结合到泛素化蛋白上，然后通过免疫沉淀或亲和层析等方法将泛素化蛋白与抗体结合，用于进一步的分析。

• 生物质谱鉴定：通过凝胶电泳或液相色谱（LC）将肽段分离后，利用质谱仪进行检测。通过质谱分析，可以定性和定量这些泛素化的蛋白质，揭示泛素化的位置和程度。常用于鉴定泛素化蛋白的质谱技术主要有选择反应监测技术（SRM）和平行反应监测（PRM）。

• 数据分析：要从质谱检测获得的大量肽段或碎片离子的信息中鉴定出目标蛋白质的序列以及修饰位点，需要用到专门的蛋白质数据库搜索工具。目前，常用的肽质量指纹谱（PMF）数据库搜索工具包括Mascot、MaxQuant和Phenyx等，用于串联质谱数据库搜索的工具有 Mascot、OMSSA、X! Tandem和pFind 等。

图3 运用质谱技术检测泛素化蛋白的一般流程

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