蛋白质磷酸化质谱分析

蛋白质磷酸化是由蛋白激酶和磷酸酶（PP）催化的一种翻译后修饰，在许多细胞过程中发挥重要作用，包括细胞周期、生长、凋亡和信号转导途径。为了理解这些机制，有必要分析蛋白质磷酸化。

磷酸化分析的方法有很多，包括激酶活性测定、磷酸化特异性抗体开发、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定 (ELISA) 以及细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学 (ICC/IHC)。除了这些方法之外，质谱（MS）分析在磷酸化分析中也发挥着重要作用。通过自下而上的蛋白质组学鉴定蛋白质磷酸化位点有两种常见策略，包括从单个蛋白质和小蛋白质复合物中鉴定磷酸化位点，以及从整个细胞和组织提取物中鉴定整体磷酸化位点。

识别特定目标蛋白质的磷酸化位点对于全面研究蛋白质磷酸化的功能作用非常重要，大致步骤如下：

1.样品制备

由于磷酸化肽段与未修饰肽段相比具有较低的化学计量水平，因此需要尽可能多地纯化蛋白质，以便成功进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。这通常是通过使用FLAG、HA或Myc等表位标签，或者使用适当的抗体进行免疫沉淀（IP）来完成的。此外，还可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或沉淀来纯化蛋白质。为了富集磷酸化肽段，有几种方法可用，包括金属离子亲和色谱（IMAC）和二氧化钛（TiO2）珠子。

2.通过 LC-MS/MS 进行分析

肽段可以通过与电喷雾电离（ESI）或基质辅助激光解吸/电离（MALDI）相结合的液相色谱引入到质谱仪中。肽段通常通过MS/MS使用碰撞诱导解离（CID）进行测序，与惰性气体的碰撞使质子化的肽段在脊椎骨的酰胺键处断裂。电子捕获解离（ECD）和电子转移解离（ETD）可以应用于磷酸化分析。

3.数据分析

需要使用信息学软件来识别肽段序列及其磷酸化对应物。一些数据库搜索引擎是可用的，包括Mascot、Sequest、MaxQuant和X!Tandem。

为了对整体磷酸化进行真正的比较分析，定量蛋白质组学策略是必要的。定量磷酸化蛋白质组学使研究人员能够研究不同模型系统中的信号通路，以识别因给定刺激而在丰度和持续时间方面发生变化的磷酸化事件。

磷酸化定量蛋白组学分析流程