质谱分析蛋白互作

蛋白质是生命活动的执行者，其功能往往体现在与其他蛋白质的相互作用中，研究蛋白-蛋白相互作用（PPI）对于人们深入了解和预防传染病、靶向治疗多基因疾病、阐明蛋白质的分子作用机制及各种复杂的生命现象具有重要意义。目前，尽管有多种技术用于研究蛋白间的相互作用，但实时捕获瞬时或弱蛋白质间的相互作用仍是研究中的一大难点。质谱技术以其独特的优势，在解决这一难题上发挥了重要作用。无论是研究简单的蛋白质复合物还是进行大规模的蛋白质组实验，质谱技术都展现出了强大的应用潜力，正逐渐成为蛋白质互作研究领域的重要工具。

质谱法检测PPI的原理在于首先借助免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（CO-IP）、亲和纯化等蛋白质相互作用分析手段，精准捕获靶标蛋白及其互作伙伴。随后，利用离子化技术将这些蛋白质转化为带电离子，再用质谱仪对离子进行分离和检测，通过分析蛋白质的质量和结构信息，揭示蛋白质间的相互作用关系。

常用于分析PPI的质谱技术有以下几种：

1、亲和纯化质谱（AP-MS）：其原理与IP-MS相似，首先是将目的蛋白固定在固体载体上（最常见的是琼脂糖或磁珠），利用目的蛋白与互作蛋白的相互作用将互作蛋白固定在载体上，从而实现从复杂混合物中的分离，随后将分离得到的混合物用质谱鉴定。该方法已成为研究蛋白质复合物以及整个生物体蛋白质组在体内相互作用的主要方法。

2、邻近标记法（PL-MS）：Co-IP 和AP-MS 需要在细胞裂解后捕获PPI，这会导致一些瞬时的、弱的相互作用被破坏。另外，在全细胞裂解液中，一些处于不同亚细胞区室的蛋白会产生生理条件下不存在的相互作用，从而产生假阳性结果。适用于体内PPI分析的邻近标记技术（PL-MS）已成为一种新的替代方法，可以克服上述问题并保留有关相互作用的空间信息。例如，在邻近依赖性生物素标记（BioID）中，诱饵蛋白与非特异性生物素连接酶（如 BirA）在胞内融合表达，这种酶可以在10 nm半径内对接近诱饵（相互作用）的蛋白质进行共价生物素化修饰，由于该反应仅发生在活细胞中，故排除了在细胞裂解后发生的生理条件下不存在的相互作用，生物素化的互作蛋白可被链霉亲和素富集，以便质谱鉴定。

3、交联质谱法（XL-MS）：AP-MS和PL-MS都需要将感兴趣的蛋白与标签或酶进行融合表达，导致分析通量受限，这意味着要想实现对蛋白质组范围 PPI 网络的剖析，需要对大量诱饵蛋白进行迭代标记，工作量非常繁重。为了在全细胞范围表征PPI，新兴技术XL-MS显示了广阔的应用前景，该方法利用小分子交联剂将相互作用蛋白质的近端氨基酸（~30 Å）进行共价连接，使得质谱能同时鉴定相互作用的蛋白质和交联位点。

质谱分析用于PPI的优势主要体现在以下几个方面：

1、高灵敏度和高分辨率：质谱技术可以检测到极低浓度的蛋白质，甚至能够识别单个氨基酸的差异，因此能够揭示蛋白质互作中的微弱或瞬时相互作用。同时，其高分辨率特性能够精确区分不同的蛋白质分子，有助于准确鉴定互作伙伴。

2、高通量：质谱技术可以同时分析多个样品，实现高通量的蛋白质互作研究。大大的加速了研究进程，提高了实验效率。

3、提供丰富的结构信息：质谱分析不仅能够鉴定蛋白质的存在，还能提供关于蛋白质结构、修饰和互作模式等详细信息，这对于理解蛋白质的功能和互作机制至关重要。

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