蛋白质组定量中的LFQ与同位素标记策略
定量蛋白质组学在当代生命科学研究中扮演着关键角色，帮助研究人员深入了解生理或病理状态下细胞系统的动态调控机制。不同于仅关注蛋白种类的“鉴定”，蛋白质定量的核心在于测量蛋白丰度的变化，从而揭示差异表达、翻译后修饰及信号通路响应等关键生物学现象。
目前，最常采用的两类基于质谱（MS）的蛋白质定量策略为：无标记定量（Label-Free Quantification, LFQ）与等重同位素标记法（如Tandem Mass Tags, TMT；以及iTRAQ）。这两种方法各具优势和局限，适用性依赖于实验设计、样本类型及分析目标。
Calvete, JJ. et al. Mass Spectrom Rev. 2024.
图1. 不同定量蛋白质组学策略的综合比较
一、非标记定量 (LFQ)
无标记定量是一种应用广泛的质谱定量策略，通过测量LC-MS分析中肽段离子信号强度或谱图计数来估算蛋白质丰度。该方法基于一个核心假设：肽段的离子信号强度与其在样本中的浓度成正比。在常规LFQ流程中，蛋白质首先经酶解为肽段，随后通过液相色谱分离，并由高分辨率质谱进行检测。样本间的定量比较通常依赖于软件对保留时间的比对与信号强度的归一化处理。
Sulaj E, et al, 2024.
图2. LFQ定量工作流程
优点：
1、无需化学标记：不依赖外源标签，避免了标记效率差异带来的误差。
2、成本较低：无需购买标记试剂，适合大样本量或预算有限的探索性研究。
3、样本灵活性高：可直接用于体液、组织或FFPE样本，无需特殊预处理。
4、广泛动态范围：可捕捉从高丰度到低丰度蛋白的变化趋势，适用于复杂生物样本。
由于LFQ无需进行化学或代谢标记，具备成本低、操作灵活的优势，尤其适用于样本数量较大或不适合进行标记的研究场景，如临床组织或体液样本。但该方法对批次间的分析波动较为敏感，因此需要借助稳健的数据归一化与统计分析方法，以确保定量结果的准确性和可比性。
二、同位素标记 (TMT/iTRAQ)
等重同位素标记方法（如TMT和iTRAQ）通过将不同样本来源的肽段共价连接上化学性质相同但同位素组成不同的标签实现定量。这些标签在质谱一级扫描中表现为相同的前体离子质量，但在MS/MS碎裂过程中可释放出具有不同质量的报告离子，从而实现多样本间的相对定量。在标记完成后，所有样本混合并在一次LC-MS/MS分析中共同检测，极大提高了实验效率和数据一致性。
图3. TMT标记定量蛋白组学工作流程
优势：
1、高通量多重分析：一次可同时分析6–18个样本，提高实验效率与一致性。
2、数据可比性强：所有样本共上机，消除技术间变异，适用于时间梯度或组学分组设计。
3、定量精度高：定量比较在同一次运行中完成，适合需要严格比较的差异分析项目。
4、适合复杂实验设计：支持多个实验组、多个处理条件同时对比分析
等重标记法的一大优势在于高通量多重分析（multiplexing）能力，可根据试剂类型实现6至18个样本的同步定量，且具有较高的定量精度和较低的技术波动，特别适用于对样本间可比性要求较高的研究，如时间梯度实验或患者队列分析。然而，该方法在MS2水平上定量时，容易受到共洗脱肽段的共隔离与共碎裂影响，导致比例失真（ratio distortion），因此在某些实验中需结合MS3或SPS-MS3等校正策略以提升定量准确性。
三、使用场景对比：不同情况下该选哪种方法
1、异质性临床样本的探索性蛋白质组学研究 → 优先选择 LFQ
在早期的发现性研究中，常涉及来源复杂、样本量有限的临床样本（如患者组织、血清、脑脊液等）。此类样本通常难以进行化学标记，LFQ作为一种无需标记的策略，可直接进行分析，极大提高样本适应性。同时，LFQ具备较宽的动态范围，适合同时检测高丰度与低丰度蛋白。但需特别注意归一化与质控流程，以保证数据准确性。
案例：Identifying potential biomarkers in plasma samples from a small cohort of disease and control subjects.
在2024年发表的一项研究中，研究团队采用Label-Free Quantification（LFQ）质谱技术，系统分析了肥胖患者在接受利拉鲁肽（liraglutide）治疗前后的血浆蛋白表达变化。研究纳入20例患者，比较治疗前后血浆样本，共鉴定出1,019个蛋白，其中151个为显著差异蛋白，涉及糖脂代谢、炎症反应、氧化应激和细胞骨架等通路。研究发现，治疗后多种炎症和代谢相关蛋白显著调控，提示利拉鲁肽可能通过多通路改善代谢状态。该研究充分展示了LFQ技术在异质性临床样本、样本量有限、标记难度大的背景下的广泛适用性和出色表现。与TMT等标记方法相比，LFQ在此类早期探索性研究中操作更简便、适应性更强，并通过标准化归一化流程有效保障了数据的可比性与定量准确性。
图4. 对PoT组和PT组肥胖患者的蛋白质组学谱进行多变量分析
图5. 对已鉴定出显著变化的蛋白质进行火山图、层次聚类 (HAC) 和热图分析
2、多种条件的大规模比较研究 → 推荐使用 TMT/iTRAQ
在需同时比较多个实验条件或生物学重复的研究中，如药物筛选、剂量梯度测试或时间序列分析，等重标签法具备显著优势。TMT等方法可实现6至18个样本在同一次LC-MS/MS运行中共同分析，大幅降低批次效应，提高定量一致性与效率。
案例： Expanding the landscape of aging via orbitrap astral mass spectrometry and tandem mass tag integration
在2025年发表于《Nature Communications》的这项研究中，研究团队结合Orbitrap Astral高分辨质谱仪与TMT 18-plex等重标记技术，对不同年龄阶段小鼠多组织样本（皮质层、海马体、纹状体和肾脏）进行系统性蛋白质组学分析。该研究通过单次LC-MS/MS运行实现18个样本的同步分析，显著降低批次效应，并实现对超过12,000个蛋白的高深度、定量一致性分析。结果揭示了多组织中蛋白随年龄变化的线性与非线性规律，特别是在大脑区域和肾脏中观察到明显的组织特异性与性别差异表达模式。该研究充分展示了TMT多重标记策略在多条件、大规模比较研究中的优势，为衰老机制解析提供了重要的蛋白质组学依据。
Keele, G.R. et al. Nat Commun. 2025.
图6. 肽段过滤结合 Orbitrap Astral 可显著提升TMT定量的准确性
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