iTRAQ 蛋白组学：标记原理、8-plex流程与和同位素/TMT的差异

iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）属同重元素标签（isobaric）家族的早期代表：多套样品在蛋白酶切后用不同同位素组成但近似相同总质量的标签酰胺化连接于肽段末端或 Lys 侧链。混合进样后的一级质谱中不同通道标签共洗脱在同一母离子群中，随后在 MS/MS（通常需较高能量）时标签区段碎裂释放出小分子 reporter ions（或再结合 low-mass balancer 差额）从而在谱图低质量区读出各样品相对比值。

经典的 iTRAQ 4-plex/8-plex 可把多组生物学条件编码进一次 LC-MS/MS 实验中，从而获得倍数变化推断；需注意通道间报告离子存在与共碎裂、基质抑制、比值压缩等技术现象——统计建模与离线分级可改善。



图 1. 碎裂释放出用于定量的 reporter 片段。

简要实验流程

蛋白酶解肽段混合物 → iTRAQ试剂标记→ 等量（或按比例） pooling → nanoLC分离 → CID/HCD/EThcD 多级质谱 → 定性搜库兼提取 reporter intensities/ratios → 归一 / 统计分析 → 可视化火山图 Heatmap。关键质控：标记效率、pH稳定性、离线分级覆盖率、生物学重复个数。



图 2. 并行标记 + 单次上机≠可以省略生物学重复。

相关服务

基于标签的蛋白质定量技术-iTRAQ，TMT，SILAC

定量蛋白组分析

基于Label Free的定量蛋白组分析

半定量蛋白质组学分析

策略对照

方案	multiplex	主要优点	主要限制
iTRAQ 8p	≤8体外通道	一次上机多维比较	比值压缩与共碎裂噪声
TMT higher plex	更多通道	通量 ↑	与 iTRAQ 共享部分系统局限
SILAC体内	≤3通道常见	低化学噪音	传代时间与培养成本
Label-free/DIA	理论无限样品	通量柔性	需统计与色谱稳定



图 3. 多维条件≠只能 iTRAQ，应回到实验设计。

FAQ

1、iTRAQ 适合组织样品吗？

可以。体外肽段标记不要求活细胞SILAC脉冲，但要注意翻译后批次效应。

2、为什么有时倍数被“压扁”？

共碎离子竞争、饱和度、离线分级不充分或软件提取模型假设均可导致比值压缩——需校正模型或补强分级。

3、必须 HCD？

不同平台碎片化效率不同；需根据仪器选择与谱图质检微调。

4、与 TMT 完全等价吗？

结构族相似但试剂化学、通道 Reporter 分布、谱图处理方式不同——不可简单当作软件参数复制。

5、iTRAQ 能否绝对定量？

常作相对比较；若需绝对摩尔浓度需 spiked 标准或非标记绝对策略辅助。

结论

iTRAQ 蛋白组学把多样品比较编码进单次质谱链路，是传统发现型差异蛋白研究的重要箭头之一。成功项目来自：合理重复、标记效率 QC、色谱深度、统计模型选择与对比值压缩现象的清醒认识。当通道数超出 8plex 或对成本/体内标记有需求时，可扩展评估 TMT、SILAC或DIA。根据科学问题交由专业团队在仪器（Orbitrap 系列 CID/HCD/EThcD 适配）和数据管线维度落地。