CO-IP后做质谱实验分组的设计

    免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法,通过使用诱饵蛋白(IP中的抗原,bait protein)特异性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白(prey protein)。

     

    在免疫沉淀串联质谱(IP-MS)实验过程中,质谱检测环节对于实验组和对照组是一致的,其差异主要体现在IP实验环节,在进行Co-IP后做质谱实验分组的设计时,重点需要明确IP环节中的实验阳性对照和阴性对照。

     

    对照组的设置是最关键的环节之一,控制变量是对照组设置的重要原则,在IP-MS实验设计中亦是如此。阳性对照的目的是证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白(IP)或者互作蛋白对(Co-IP,比如诱饵蛋白X和靶蛋白Y),即为常说的input。可直接取抽好的蛋白溶液进行Western。

     

    IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了,为了排除假阳性的结果,还得做个阴性对照。需要考虑到整个实验体系会出现beads、抗X抗体、诱饵蛋白X、靶蛋白Y(Co-IP)。同时,为了避免单次实验的偶然误差,尽可能增加重复实验次数,这对于筛选出高可信度的相互作用蛋白尤为重要,并且会大大降低后期蛋白相互作用验证的工作量。所以整体来看,增加了结果可靠性。

     

    此外,内源性Co-IP实验分析如果最终结果为阳性,则可以证明两个蛋白之间存在相互作用;但是结果为阴性,是否两个蛋白就一定不发生相互作用了呢?也不一定。有可能是两个蛋白是弱相互作用力,这时候可能需要交联剂协助,锁定强化弱互作蛋白;也有可能是内源蛋白表达量低,可先做过表达Co-IP作为对照。

     

    百泰派克生物科技针对样品蛋白的提取、表达和纯化的优化方案可确保获得高质量的诱饵和猎物蛋白,为客户提供优质的免疫共沉淀法(CO-IP)结合质谱联用的蛋白互作分析服务。您只需要将您的需求和样品寄给我们,我们会负责项目后续所有事宜,包括样品前处理、蛋白互作实验、质谱分析、质谱原始数据分析。

     

    相关服务:

    蛋白质相互作用分析 

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    交联法蛋白相互作用分析 

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