IP样品考染

IP样品考染即将免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）拉下的蛋白样品电泳后进行考马斯亮蓝染色。在获得IP样品之后，质谱检测之前，一般需要将IP样品进行电泳预实验以评估其质量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝染色（简称考染）预实验可评估IP样品蛋白量，从而评估该IP样品是否适用于质谱检测。若考染结果表明IP样品中蛋白量较高且差异明显，则可将该IP样品进行后续的质谱送样检测。否则应该优化和更改实验条件，重新制备样品后，再进行预实验验证并进行质谱检测。

考染的原理：考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中可与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。由于吸光度值与蛋白浓度成正比，在595nm下测定的溶液的吸光度值并通过相应的数学计算即可得到样品中蛋白质的浓度。

IP样品考染过程主要包括染色和脱色两个步骤，首先制备考马斯亮蓝染色液和脱色液，之后需要分别进行考马斯亮蓝染色和脱色操作。

考马斯亮蓝染色液：称取1 g考马斯亮蓝R-250溶于400 mL ddH2O中，加入450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，最后加ddH₂O定容至1 L。

脱色液：甲醇100 mL，冰醋酸100 mL，ddH₂O定容至1 L。

考马斯亮蓝染色和脱色：将电泳后的PAGE胶取下放在塑料盒中，加入适量考马斯亮蓝染色液进行染色，于室温摇床上慢慢摇动30 min（在染色过程中无需颜色过深，否则脱色反而费时）。之后将胶转移至脱色液中，在摇床上摇动5-10 min，弃去脱色液（此时蛋白条带应已可见），可换脱色液继续脱色至条带清晰。若要快速染色，可进行加热至沸腾，取出后置于室温摇床上慢慢摇动10 min即可。

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