磷酸化蛋白和总蛋白wb怎样分析
一、电泳和转膜
首先,将样品通过SDS-PAGE电泳分离,然后将电泳完的样品转移到PVDF膜上。
二、封闭
转膜后,要先用5%脱脂牛奶或BSA在TBST缓冲液中封闭膜,防止非特异性结合。
三、带抗体孵育
封闭后,使用抗磷酸化蛋白或抗总蛋白抗体在4℃孵育过夜。具体的抗体选择要根据实验的需求来。
四、洗膜和二抗孵育
抗体孵育完成后,要用TBST缓冲液洗膜,并使用二抗进行孵育。
五、洗膜和显影
二抗孵育完成后,再次用TBST缓冲液洗膜,然后使用ECL显像液进行显影。
六、分析
最后,对显影后的结果进行分析。一般来说,磷酸化蛋白的灰度值需要用对应的总蛋白值进行归一化。
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