如何鉴定蛋白质和蛋白质样品制备的建议
- 考马斯亮蓝、SYPRO Ruby和银染色样品均可用于蛋白质鉴定。
- 银染样品可能与后续质谱分析不兼容。建议您使用以下产品或实验程序进行银染实验:
- 此外,请不要使银染的样品变色。
随着高分辨率质谱分析技术的发展,蛋白质质谱方法已经变得相当复杂。一次实验完成鉴定低丰度蛋白质样品和多个蛋白质样品已不再困难。然而,由于质谱的高灵敏度,外源引入的蛋白质可能会在质谱中引起假阳性。因此,在制备蛋白质样品时,我们必须小心避免引入外源蛋白质污染物。此外,蛋白质样品的制备还需要使用与质谱检测兼容的溶液和试剂,这可以大大提高质谱鉴定的准确性。
根据经验,我们将向您介绍蛋白质质谱鉴定的每个详细过程,以及在蛋白质样品制备中应注意的事项。
蛋白质质谱的一般过程
首先,您需要破碎细胞或组织样品,有很多方法可以破碎它们。大多数细胞可以通过使用常见的细胞裂解试剂(如RIPA缓冲液),添加蛋白酶抑制剂和还原剂来裂解。组织可以通过低温均质、液氮冷冻等方法破碎。
其次,将样品以12000rpm的转速离心10分钟,去除不溶性细胞成分。
液体蛋白质样品可以使用抗体进行富集、纯化和IP处理,然后可以浓缩待检测的蛋白质。蛋白质也可以使用1D/2D-PAGE凝胶分离。
浓缩的液体蛋白质消化后,采用LC-MS/MS进行分析。要求蛋白质凝胶样品切除与目标蛋白质分子量相同的蛋白质条带,并对蛋白质进行凝胶内消化和质谱检测。
分析质谱鉴定的数据,获得高度可靠的蛋白质肽序列,然后与蛋白质数据库进行比较,得到蛋白质鉴定。
样品类型
细胞样品:微生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌和细菌
组织样品:动物组织、植物组织
体液样品:血清、血浆、尿液等
样品数量
样品类型 |
蛋白质 |
细胞样品 |
动物组织 |
植物组织 |
血液(EDTA抗凝) |
血清 |
尿液 |
酵母,微生物样品 |
样品量 |
100μg |
1×107 |
1g |
200mg |
1mL |
0.2-0.5mL |
2mL |
200mg(干重) |
蛋白质样品制备的建议
浓缩样品
蛋白质样品可以通过沉淀、膜分离、分离柱、冷冻干燥等多种方法进行浓缩。用户应根据样品的特性选择合适的方法。SDS样品溶液可以洗脱色谱样品中的蛋白质,从而保持样品的小体积。
电泳凝胶
对于SDS-PAGE,传统的Laemmli-type、triglycine凝胶和各种其他改性凝胶(如二、三或三盐酸盐凝胶)都可以用于蛋白质鉴定。各种凝胶的浓度没有限制。用户选择的凝胶类型和浓度应根据样品的正确分离来确定。
蛋白质凝胶染色
ProteoSilver Plus,Sigma(Product # PROTSIL1或PROTSIL2)
Dodeca Silver Stain,BioRad(Product # 161-0481或161-0480)
液体样品
在样品制备过程中尽量减少使用SDS等表面活性剂,并注意降低盐浓度。如果您提交IP洗脱样品,建议使用HPH EB(0.5M NH4OH,0.5mM EDTA)缓冲液系统来洗脱最后一步的蛋白质,以确保洗脱缓冲液系统与后续质谱实验兼容。
切割蛋白条带
在切割过程中,无论您的手、灯箱或任何其他可能的角蛋白污染源,都要避免直接接触凝胶。切割蛋白凝胶条带时,尽量避免切割空白凝胶(这可能会降低消化效率和多肽回收率)。将每个凝胶带放入干净的1.5ml微量离心管中,并仔细标记每个样品。
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