如何鉴定蛋白质和蛋白质样品制备的建议

随着高分辨率质谱分析技术的发展，蛋白质质谱方法已经变得相当复杂。一次实验完成鉴定低丰度蛋白质样品和多个蛋白质样品已不再困难。然而，由于质谱的高灵敏度，外源引入的蛋白质可能会在质谱中引起假阳性。因此，在制备蛋白质样品时，我们必须小心避免引入外源蛋白质污染物。此外，蛋白质样品的制备还需要使用与质谱检测兼容的溶液和试剂，这可以大大提高质谱鉴定的准确性。

根据经验，我们将向您介绍蛋白质质谱鉴定的每个详细过程，以及在蛋白质样品制备中应注意的事项。

蛋白质质谱的一般过程

首先，您需要破碎细胞或组织样品，有很多方法可以破碎它们。大多数细胞可以通过使用常见的细胞裂解试剂（如RIPA缓冲液），添加蛋白酶抑制剂和还原剂来裂解。组织可以通过低温均质、液氮冷冻等方法破碎。

其次，将样品以12000rpm的转速离心10分钟，去除不溶性细胞成分。

液体蛋白质样品可以使用抗体进行富集、纯化和IP处理，然后可以浓缩待检测的蛋白质。蛋白质也可以使用1D/2D-PAGE凝胶分离。

浓缩的液体蛋白质消化后，采用LC-MS/MS进行分析。要求蛋白质凝胶样品切除与目标蛋白质分子量相同的蛋白质条带，并对蛋白质进行凝胶内消化和质谱检测。

分析质谱鉴定的数据，获得高度可靠的蛋白质肽序列，然后与蛋白质数据库进行比较，得到蛋白质鉴定。

样品类型

细胞样品：微生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌和细菌

组织样品：动物组织、植物组织

体液样品：血清、血浆、尿液等

样品数量

样品类型	蛋白质	细胞样品	动物组织	植物组织	血液(EDTA抗凝)	血清	尿液	酵母，微生物样品
样品量	100μg	1×10⁷	1g	200mg	1mL	0.2-0.5mL	2mL	200mg（干重）

蛋白质样品制备的建议

浓缩样品

蛋白质样品可以通过沉淀、膜分离、分离柱、冷冻干燥等多种方法进行浓缩。用户应根据样品的特性选择合适的方法。SDS样品溶液可以洗脱色谱样品中的蛋白质，从而保持样品的小体积。

电泳凝胶

对于SDS-PAGE，传统的Laemmli-type、triglycine凝胶和各种其他改性凝胶（如二、三或三盐酸盐凝胶）都可以用于蛋白质鉴定。各种凝胶的浓度没有限制。用户选择的凝胶类型和浓度应根据样品的正确分离来确定。

蛋白质凝胶染色

考马斯亮蓝、SYPRO Ruby和银染色样品均可用于蛋白质鉴定。
银染样品可能与后续质谱分析不兼容。建议您使用以下产品或实验程序进行银染实验：

ProteoSilver Plus，Sigma（Product # PROTSIL1或PROTSIL2）

Dodeca Silver Stain，BioRad（Product # 161-0481或161-0480）

此外，请不要使银染的样品变色。

液体样品

在样品制备过程中尽量减少使用SDS等表面活性剂，并注意降低盐浓度。如果您提交IP洗脱样品，建议使用HPH EB（0.5M NH4OH，0.5mM EDTA）缓冲液系统来洗脱最后一步的蛋白质，以确保洗脱缓冲液系统与后续质谱实验兼容。

切割蛋白条带

在切割过程中，无论您的手、灯箱或任何其他可能的角蛋白污染源，都要避免直接接触凝胶。切割蛋白凝胶条带时，尽量避免切割空白凝胶（这可能会降低消化效率和多肽回收率）。将每个凝胶带放入干净的1.5ml微量离心管中，并仔细标记每个样品。

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