生物制品电荷异质性分析之等电点分析

蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点（isoelectric point, pI）。蛋白的等电点与其氨基酸序列和三维结构密切相关，特定蛋白的等电点是固定的，因此可以通过比较不同蛋白质的等电点来研究它们的结构和功能差异，精确测定等电点是生物制品电荷异质性表征的重要一环。

北京百泰派克生物科技有限公司基于CNAS/ISO9001双重质量认证体系，根据毛细管等电聚焦（cCIEF）和等电聚焦（IEF）原理，建立了针对于不同类别生物制品的蛋白等电点检测平台，可实现对蛋白、抗体、疫苗、多肽、重组胶原蛋白等生物制品的等电点的精确测定。

一、基于cCIEF的蛋白等电点分析

1.原理：

cCIEF是一种特殊的微分离技术，是表征蛋白质电荷不均一性的强有力工具。cIEF的其原理是在毛细管两端加上直流电压，毛细管内的载体两性电解质可以形成一定范围的pH梯度，蛋白质依据其所带电荷向阳极或阴极移动，直到净电荷为0的某个pH值（即等电点pI）时停止，最终蛋白质聚焦成很窄的区段，从而达到分离的目的，并获得该蛋白质的等电点信息。

2.实验仪器：

BECKMAN COULTER PA800+毛细管电泳仪

3.应用：

cCIEF具有分析时间短、分辨率高、重复性好、精确度高、样本用量少等优点。该方法已经成为多种氨基酸、多肽、重组蛋白、抗体、疫苗等生物制品研发与质量控制中的关键技术之一。

4.案例示意：

实验过程中，将样品与两性电解质及5种标准的pI Marker混合，使用毛细管电泳仪检测，在毛细管中电泳聚焦，根据5种内标的保留时间，计算出供试品等电点。

pI marker结果

单抗样品检测结果

二、基于IEF的蛋白等电点分析

1.原理：

IEF的原理是两性电解质形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测生物制品等电点的目的。

2.实验仪器：

GE公司的Ettan IPGphor 3

3.应用：

基于cCIEF的等电点分析，检测器采集280nm处的吸收峰。对于280nm处无吸收峰的生物制品，例如胶原蛋白，cCIEF的方法显然不太合适。基于IEF的方法是对280nm处无吸收峰蛋白等电点检测的有效补充，并在胶原蛋白类生物制品和医疗器械表征中得到广泛应用。

4.案例示意：

实验过程中，一根胶条用来测试Marker，对预制胶条的pI分布情况进行校准，另外一根胶条用来测试样品；两根胶条同时进行等电聚焦以减少系统误差。

左边为pI marker结果，右边为胶原蛋白样品结果

典型问答：

问题1：为什么多数蛋白质的等电点是中性偏酸性？

回答：蛋白质是由氨基酸组成的，而大多数氨基酸等电点小于人体的pH（pH=7.4），故而大多数的蛋白质的等电点偏酸性，如山羊胃蛋白酶等电点约为3。

问题2：有没有等电点偏碱性的蛋白质？

回答：存在pI碱性的蛋白质。当蛋白质中的碱性氨基酸，如组氨酸，精氨酸、赖氨酸、比列较大，会导致等电点偏碱性，如鱼精蛋白等电点约为12。

问题3：做等电点检测，两种检测方法如何选择？

回答：基于cCIEF的等电点检测需要样品具有280nm的紫外吸收；不具有280nm的紫外吸收的样品（例如胶原蛋白）进行基于IEF的等电点检测。

生物制品电荷异质性分析之等电点分析

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