生物制品表征之氨基酸组成分析和消光系数分析

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是构成蛋白质的结构单位。氨基酸组成分析是对多肽、抗体和蛋白等生物制品的氨基酸成分及其含量进行测定和分析。通过分析结果可以初步了解多肽/蛋白质的化学结构特点，某些特征活性氨基酸的分布情况，为多肽/蛋白质结构与功能的研究提供科学的信息。

 

百泰派克生物科技BTP基于高效液相色谱（HPLC）建立了氨基酸组成分析方法，并通过了CNAS实验室认可，可以为您提供直接的生物制品氨基酸组成分析检测和完整的方法学建立&验证&转让服务。

 

基本原理

 

蛋白或多肽样品经过水解后得到单个氨基酸。氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)试剂与伯胺和仲胺均可发生反应，从而完成对于单个氨基酸的衍生化标记。标记完成之后的氨基酸有紫外吸收，利用同种物质相同条件下出峰时间相同的原理对样品的各个色谱峰与具体氨基酸对应，从而根据峰面积与浓度的关系计算出样品中各种氨基酸的浓度。



 

一般流程

 

蛋白或多肽样品经过水解后用基于高效液相色谱（HPLC）的柱前衍生法对水解后的氨基酸进行分析，得到数据之后对数据进行计算处理，最后得到每种氨基酸的含量占比等信息。具体过程如下：



 

应用

 

氨基酸组成分析可检测多肽、抗体和蛋白的氨基酸成分及其相对含量，比较不同批次样本的稳定性，侧面反应序列准确性等。通过氨基酸组成分析得到的氨基酸个数可以进一步计算出蛋白的消光系数。

 

案例展示

 



氨基酸标准品紫外吸收色谱图（横坐标为时间，纵坐标为紫外吸收）

 



供试品紫外吸收色谱图（横坐标为时间，纵坐标为紫外吸收）

 

根据标准品和样品的的峰面积与浓度的关系计算出样品中各种氨基酸的浓度；按照下方公式可以计算出对应的氨基酸个数。

 

氨基酸个数=（总蛋白分子量*氨基酸浓度）/（样品浓度*氨基酸分子量）

 



根据蛋白浓度计算蛋白的消光系数：根据Lambert-Beer定律，当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比。因此，只需测得蛋白的绝对含量和1 cm 光程下供试品在 UV 280 nm 波长下的消光值即可用公式ℇ=A/cl计算蛋白的消光系数。

 

如果已知氨基酸序列，可用氨基酸绝对含量计算蛋白质或肽的绝对含量，进而计算蛋白的消光系数。

 

吸光光度值测定：



 

氨基酸组成分析：



 

消光系数计算：



 

常见问题

 

问题1：为什么结果中有些氨基酸没有检测到？（是否所有氨基酸都能被检测到）

回答：酸水解后Asn转化为Asp，Gln转化为Glu，Trp全部被破坏, Met和Cys氧化严重。

 

问题2：为什么测氨基酸组成分析需要做柱前或柱后衍生？

回答：部分氨基酸的结构导致没有特征吸收峰，如果不衍生的话用DAD或者荧光检测器是检测不出来的。必须经过衍生带上发光基团才能被检测出来。另外，衍生化可使氨基酸趋于中性，利于得到较好的色谱分离，保证重现性。

 

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