基于DIA/SWATH的蛋白质翻译后修饰定量分析

蛋白质翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）在调控细胞功能、信号转导、代谢过程及疾病发生中扮演着核心角色。磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等修饰形式，为蛋白质赋予了时空特异性和功能多样性，是理解蛋白功能状态的重要线索。随着质谱技术的发展，数据独立采集（Data-Independent Acquisition, DIA）尤其是SWATH-MS（Sequential Windowed Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra）策略，正在成为PTM定量研究的重要手段，以其高通量、高重复性、无偏性等特点，助力科研人员实现对复杂生物样本中修饰蛋白的系统解析。

 

一、蛋白质翻译后修饰的复杂性与挑战

蛋白质翻译后修饰具有高度复杂性。一方面，多种修饰类型可作用于同一蛋白甚至同一氨基酸残基上，形成调控的协同或拮抗作用；另一方面，修饰通常以低丰度存在，且变化迅速，受细胞状态、外部刺激和发育阶段影响显著。此外，修饰位点的异构性也对分析提出了更高的分辨需求。在识别和定量这类修饰分子时，常受限于数据获取的片段性和样本重复性不高等问题，难以满足系统性研究的需求。基于DIA/SWATH的质谱采集方式，恰好以其覆盖全面、定量精确的特性，为翻译后修饰研究打开了新的可能性。

 

二、DIA/SWATH-MS：构建高维度的修饰蛋白质组数据

DIA/SWATH技术的基本原理是将整个质谱扫描范围划分为若干窗口，依次对所有窗口内的前体离子进行同步碎裂，并采集其全部MS/MS信息。这种采集策略不依赖前体强度，不会遗漏低丰度信号，能够在同一次分析中获取完整的片段谱图，从而实现对样本中所有可检测肽段的无偏分析。

在翻译后修饰研究中，这种采集模式带来了三大关键优势：

1、全面性与一致性

所有样本在相同条件下均被采集相同的数据维度，显著提升了不同实验批次、不同处理组间数据的可比性和稳定性。这对于动态修饰事件的追踪，如药物处理、细胞周期、炎症应答等研究场景尤为重要。

 

2、位点级别的修饰信息捕获

PTM定量的核心不仅在于检测修饰肽段，更在于精确定位修饰位点。DIA数据的高覆盖度使得研究人员可以借助高质量的谱图库或预测算法，对修饰位点进行准确判定，实现从肽段层面向位点层面的深入拓展。

 

3、适配复杂样本和多条件比较

在多组样本、多种处理条件的大规模实验设计中，DIA数据具有良好的批间一致性和高通量处理能力，可有效支持多变量统计分析、时间序列建模和系统生物学网络构建。

 

三、DIA在翻译后修饰研究中的关键流程

DIA/SWATH技术的高效运用，需依赖一整套优化流程，从样本前处理到数据分析，环环相扣。

1、修饰肽段的特异性富集

翻译后修饰常表现为低丰度、短暂且易受环境影响。为增强其在质谱中的检测能力，富集策略是第一道“筛选门槛”。例如，磷酸化通常使用金属离子亲和层析（IMAC）或二氧化钛（TiO₂）富集，乙酰化与泛素化则常依赖于特异性抗体进行免疫富集。高选择性与低非特异性结合率，是确保DIA分析成功的基础。

 

2、DIA谱图库构建与修饰信息整合

在DIA分析中，谱图库是实现修饰肽段识别与定量的核心资源。可采用两种方式进行构建：

• 实验谱库：通过前期DDA实验获取修饰肽段的碎片谱图，构建针对性强的定制库；

• 预测谱库：利用机器学习模型（如Prosit、DIA-NN）根据肽段序列预测其MS/MS特征，快速生成大规模、高覆盖率的修饰谱库。

高质量的谱图库，能显著提升修饰肽段的检出率和定量精度，尤其对于未知修饰位点的探索具有重要意义。

 

3、数据分析与生物学解释

PTM数据分析不仅关注定量水平的变化，更强调生物学意义的挖掘。例如：

• 位点特异性差异分析：识别在不同条件下显著变化的修饰位点；

• 修饰网络构建：解析特定修饰类型在信号通路、转录调控中的参与角色；

• 修饰间交互研究：探索磷酸化与乙酰化、泛素化之间的协同或竞争作用。

目前，已有多种专门用于DIA数据的分析软件支持PTM研究（如Spectronaut、DIA-NN、Skyline），可帮助科研人员从复杂数据中提取具有生物学意义的修饰信号。

 

基于DIA/SWATH的蛋白质翻译后修饰定量分析使研究者能够在大规模样本中稳定、准确地识别和量化修饰位点，推动生命科学从“结构识别”走向“功能解码”。百泰派克生物科技致力于为科研工作者提供高质量的SWATH定量蛋白组学服务，助力探索蛋白修饰的精细调控机制，共同推进生命科学的边界。

 

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