如何提高空间蛋白组学的灵敏度和覆盖度？

空间蛋白组学融合了蛋白质组学与组织空间信息，其目标是在亚细胞甚至亚组织层面，实现蛋白质表达与定位的高分辨率映射。在癌症微环境、神经退行性疾病、发育生物学等领域，空间蛋白组数据可揭示传统bulk蛋白质组无法捕捉的生物学规律。

然而，空间蛋白组学面临的两大核心挑战是：

• 灵敏度不足：组织中某些关键蛋白表达极低，易被忽略；

• 覆盖度有限：样本量小导致蛋白谱不完整，影响生物学解释。

提升灵敏度与覆盖度，是确保空间蛋白组学研究质量的关键。

一、样本制备优化：从源头减少蛋白损失

样本制备是影响蛋白检测灵敏度的首要因素。在空间蛋白组学中，常涉及微量样本（如激光微切、FFPE组织切片等），蛋白含量极低。因此必须从取材到裂解全流程精细化操作。

关键策略：

• 低吸附耗材和试剂：选用低蛋白吸附的EP管和移液枪头，减少蛋白吸附损失。

• 优化裂解缓冲液配方：针对FFPE或冻存组织，使用含有SDS、urea或脱交联剂的裂解液，提高蛋白释放效率。

• 采用SP3磁珠法富集：SP3方法已被证实在微量蛋白处理中的高回收率、高重现性，适合空间蛋白组样本处理。

二、质谱平台升级：选择高分辨率、高灵敏度仪器

空间蛋白组学对质谱平台提出极高要求，需要在有限进样量下识别更多蛋白。常见策略包括使用超高灵敏度的Orbitrap系列仪器，结合前沿的数据采集模式。

1、仪器平台推荐：

• Orbitrap Eclipse Tribrid：结合三重质量分析器架构，适用于微量样本的深度分析；

• timsTOF SCP（Bruker）：专为低样本量设计，搭载PASEF加速技术，可在<1ng蛋白中检测3000+蛋白；

• Exploris 480/240 + FAIMS Pro：通过FAIMS技术实现离子筛选，提高低丰度蛋白的识别概率。

2、采集模式优化：

• DIA（Data-Independent Acquisition）：相比DDA，DIA可在重复性更高的前提下显著提高蛋白识别数量，尤其适用于微量样本；

• BoxCar 或 Boosting 技术：通过信号增强策略提高低丰度蛋白的检测能力；

• 微流控LC-MS接口（nanoLC）：极大增强进样效率和电离效率，是空间蛋白组的常规配置。

三、空间定位技术融合：助力高分辨率空间分布图谱

传统蛋白组学缺乏空间信息，因此空间蛋白组常需与影像辅助标记技术结合，如：

• 免疫荧光引导微区采样（IF-guided Microdissection）

• 成像质谱（Imaging MS）

• CODEX/ImmunoSABER等空间多重免疫标记技术

这些方法可实现特定区域（如肿瘤边缘、免疫细胞聚集区）的定向蛋白组分析，提高空间信息的精度。

特别是激光微切（Laser Capture Microdissection, LCM）结合质谱分析，已成为空间蛋白组的重要手段。但LCM后的样本常极微量（<100个细胞），需结合极致灵敏度的质谱平台和富集策略。

四、数据分析与数据库支持：提高鉴定率与定量精度

即使获取了高质量的质谱原始数据，分析方法的先进程度也会显著影响最终的蛋白质识别量和定量精度。

推荐策略：

• 构建组织特异性的蛋白质参考库：结合转录组、参考谱库提高识别率；

• 采用深度学习辅助搜索算法：如DIA-NN、MSFragger等工具可提升低丰度蛋白鉴定能力；

• 批量样本归一化处理：避免技术偏差掩盖真实生物学差异。

五、总结：提升空间蛋白组学灵敏度与覆盖度的全流程优化路径

环节	提升策略
样本制备	微量SP3富集、低吸附材料、优化裂解条件
质谱平台	高灵敏质谱仪（如Eclipse、timsTOF SCP）、nanoLC系统
采集模式	DIA、BoxCar、Boosting、FAIMS技术
空间引导	激光微切、免疫标记、成像质谱结合
数据分析	深度学习搜索引擎、定制参考库、多层次归一化

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