SILAC如何助力磷酸化修饰研究？

Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture（SILAC，稳定同位素标记的细胞培养）广泛应用于定量蛋白质组学的代谢标记。相比于iTRAQ、TMT等化学标记方法，SILAC因其在细胞水平完成同位素标记，天然避免了样本处理过程中引入的偏差，成为研究蛋白质翻译后修饰（PTMs），特别是磷酸化修饰研究的重要工具。本文将深入探讨 SILAC如何助力磷酸化修饰研究，并结合实际案例介绍如何通过高分辨质谱平台获取更具生物学意义的结果。

 

一、SILAC技术原理

SILAC的基本思路是：在细胞培养基中分别添加“轻”氨基酸（如[^12C6]-赖氨酸）和“重”氨基酸（如[^13C6]-赖氨酸），通过多代培养，使蛋白质在合成时引入稳定同位素，从而在质谱中呈现出特征性的质量差异。不同处理组细胞经过SILAC标记后混合，统一进行裂解、消化、富集等操作，最后用质谱对蛋白质或修饰肽段进行定量分析。

 

二、SILAC在磷酸化修饰研究中的优势

1、高精度的定量能力

磷酸化是一种高度动态的修饰，响应信号通路变化极为迅速。SILAC技术由于样本在细胞水平标记，后续所有实验步骤均在混合样本上进行，能有效避免批次效应，提高定量的准确性和可重复性，非常适合捕捉动态磷酸化变化。

 

2、与磷酸肽富集技术兼容性强

SILAC样本可直接与TiO₂、IMAC、Fe-NTA等磷酸肽富集策略联用，实现低丰度磷酸肽的特异性富集和定量。这对于研究信号转导通路中的关键调控位点尤为关键。

 

3、可实现时间分辨的动力学分析

通过三重标记（如light、medium、heavy），SILAC可用于模拟信号刺激后的不同时刻，进而追踪磷酸化修饰的时间动态变化，揭示信号通路的启动、放大与终止机制。

 

三、SILAC磷酸化修饰研究的应用场景

1、解析激酶底物网络

例如在研究EGF（表皮生长因子）刺激下的信号传导时，可用SILAC分别标记处理组和对照组细胞，富集磷酸肽后进行质谱分析，从而识别出EGFR激酶的下游磷酸化靶点，绘制激酶-底物调控网络。

 

2、药物作用机制研究

对于靶向激酶抑制剂的研发，可使用SILAC监测药物处理前后细胞中磷酸化位点的整体变化，从而判断药物对信号通路的调控效果及潜在脱靶风险。

 

3、肿瘤信号通路研究

癌症细胞常伴随异常的磷酸化信号激活。通过SILAC+磷酸肽富集+高分辨率质谱，可系统性比较肿瘤与正常细胞在磷酸化层面的差异，为靶点发现提供数据支撑。

 

四、SILAC磷酸化修饰研究的实验流程概览

1、细胞培养：使用含轻/重标记氨基酸的培养基进行3~6代培养

2、处理干预：比如药物刺激、激酶激活或抑制等

3、混合样本：不同条件下的细胞裂解后按比例混合

4、蛋白消化：胰蛋白酶酶解为肽段

5、磷酸肽富集：TiO₂、Fe-NTA等方式提取磷酸化肽段

6、LC-MS/MS分析：使用高分辨质谱平台（如Orbitrap Fusion Lumos）

7. 数据分析：MaxQuant、Perseus等软件进行定量与统计分析

 

五、百泰派克生物科技的解决方案

百泰派克生物科技提供基于SILAC的磷酸化蛋白质组学整体解决方案，包括但不限于：

• 高纯度重标记氨基酸定制与细胞标记优化

• 磷酸肽富集与多轮富集流程

• Orbitrap高分辨质谱平台分析

• 基于MaxQuant/Perseus的定量数据挖掘服务

• 磷酸化位点注释、通路富集与网络构建

 

服务项目涵盖肿瘤信号研究、激酶抑制剂靶点筛选、受体通路动力学建模等，助力科研客户在蛋白修饰调控机制研究中取得高水平成果。

 

SILAC技术以其内源标记、定量精准、适配多种修饰富集策略的优势，已成为磷酸化蛋白质组学研究的核心手段之一。未来，随着质谱技术和数据分析工具的不断进步，SILAC有望在更广泛的PTM研究中发挥关键作用。若您计划开展SILAC定量磷酸化研究，欢迎联系百泰派克生物科技，我们将以高质量的技术服务和项目管理助力您的磷酸化修饰研究。