DIA技术在泛素化蛋白组学中的应用
泛素化（ubiquitination）是一种重要的蛋白翻译后修饰（PTM），通过将76氨基酸的泛素分子连接到底物蛋白上的赖氨酸残基，调控蛋白稳定性、信号传导、DNA修复等过程。传统质谱方法如DDA（数据依赖采集）在泛素化肽段捕获方面虽有所建树，但存在信号偏倚和数据缺失的问题。近年来，Data-Independent Acquisition（DIA）技术 diGly 特异性抗体富集，从而实现泛素化蛋白组的高通量、定量分析，DIA技术已成为泛素组学研究中不可或缺的工具之一，尤其适用于解析低丰度泛素化修饰、提高跨样本可比性以及支撑大规模功能筛选实验。
一、泛素化结合Data-Independent Acquisition（DIA）技术的原因
1、全谱无偏采集，增强数据完整性
（1）DIA通过预设m/z窗口对所有前体离子进行碎片化，实现“无遗漏”采集。
（2）相较于DDA只选择高丰度肽段，DIA显著降低采集偏倚，有效捕获低丰度泛素化肽段，提高实验重现性。
2、重复性与定量准确性提升
（1）DIA的定量覆盖更加稳定，跨样品的丢失值更少，定量CV值通常低于DDA。
（2）这对于比较病理与正常状态、筛选潜在DUB/E3靶标尤其关键。
二、DIA-Ubiquitinomics 的实验流程
1、样本制备 Sample Preparation
（1）细胞或组织裂解后，使用胰蛋白酶消化。
（2）紧接着使用anti-diGly抗体选择性富集含残余甘氨酰赖氨酸的泛素化肽段，是DIA泛素组学实验的核心步骤。
2、光谱谱图库构建 Spectral Library Building
（1）为提高匹配效率，通常通过DDA或in silico生成大型肽段光谱库。
（2）如 Hansen 等人采用 90 000+ 个 diGly 肽段建立谱库，在DIA单次RUN中可识别高达 35 000 个diGly位点。
3、DIA-MS采集
（1）基于Orbitrap等高分辨质谱仪器，采用变量窗口机制进行DIA采集。
（2）确保泛素化信号全面覆盖，增强定量线性。
（3）搭配Spectronaut、DIA-NN等软件解析，实现高通量结果输出。
4、数据处理与定量分析
（1）除传统Library-based匹配，也可使用library-free模式（directDIA）。
（2）尤其在样本有限或谱库不完整时更具优势，例如单细胞DIA中已有报道。
三、典型研究案例展示
1、环境响应与信号通路应用
（1）Hansen等人通过 DIA 检测 TNF 信号通路中泛素化位点，发现大量新靶点。
（2）揭示泛素化调控节律蛋白内在时间循环规律。
2、药物作用机制挖掘
（1）Steger 等研究者使用 DIA 定量 70 000+ 泛素化位点。
（2）明确USP7抑制剂的即刻作用靶点，如 2 分钟内出现大量泛素化变化。
3、单细胞级别泛素组学
（1）最新单细胞DIA工作已能够在单细胞或少量细胞中鉴定数百个或上千个泛素化肽段。
（2）这一进展将推动泛素组学在细胞异质性、癌症微环境等领域的深入应用。
四、DIA-Ubiquitinomics 的优势总结
五、DIA技术与泛素化蛋白组学结合挑战
1、光谱库构建的成本与质量控制
（1）大型谱库依赖DDA运行，成本高，实验室需投注更多资源。
（2）谱库质量直接影响DIA结果层次。
2、链型识别困难
虽然DIA对位点捕获增强，但尚需结合并行方法（如中性丢失检测、化学探针）实现多泛素链类型的定性和定量。
3、数据分析门槛高
（1）DIA数据复杂，需依赖Spectronaut、DIA-NN等算法平台。
（2）高性能计算资源及经验对可靠输出至关重要。
六、DIA技术与泛素化蛋白组学结合前景展望
1、单细胞泛素组学的进一步普及
2、双修饰（如Co-existing PTM）联合定量分析
3、人工智能算法与in‑silico谱库的深度融合
4、临床样本的普遍适配与规模化平台应用
七、百泰派克生物科技的DIA泛素组学优势
百泰派克生物科技拥有成熟的DIA-Ubiquitinomics技术平台：
1、自主优化抗体富集流程：在细胞与组织样本中高效提取 target diGly 肽段
2、定制化谱库构建：结合DDA与in-silico库策略，支持项目级谱库生成
3、专业数据分析团队：采用Spectronaut、DIA-NN等工具，供应整合式数据解读报告
4、特定研究领域服务：包括循环节奏、生物药研发、单细胞分析以及药物机制研究
DIA技术已经成为泛素化蛋白组学研究中的重要技术路径。如果您也计划应用DIA 技术探索细胞周期调控、疾病机理或药物作用机制，百泰派克生物科技期待为您提供全流程定制服务，从样本处理到数据解析，助力科研取得卓越成果！如需进一步了解服务细节、技术路线图和合作方案，欢迎联系百泰派克生物科技专家团队，我们将为您的科研项目保驾护航。
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