标记定量蛋白质组学 Q&A
Q1：什么是标记定量蛋白质组学？
A1：标记定量蛋白质组学是通过化学或同位素标签对蛋白质或肽段进行标记，从而在质谱分析中区分不同样本，实现相对或绝对定量的技术。常见方法包括iTRAQ、TMT和SILAC 。
Q2：基于SILAC、iTRAQ/TMT 的蛋白定量有什么区别？
A2：
SILAC：是一种在细胞培养过程中使用的代谢标记方法，通常支持 2-3 重（使用 NeuCode 最多可支持 4 重以上）。定量在一级质谱 (MS1) 水平进行。
iTRAQ：是一种化学同位素标记方法，支持 4-8 重。定量在二级质谱 (MS2) 水平进行。
TMT：也是一种同位素化学标记技术，支持 10-18 重，适用于大规模、高通量研究。定量在二级质谱 (MS2) 水平进行。
Q3：与非标记方法相比，基于标记的定量蛋白质组学有哪些优势？
A3：基于标记的蛋白质组学由于所有样品同时混合和分析，因此定量准确度更高，样品间的重现性也更好。它还能减少因单独运行而造成的技术差异，并支持多重分析，允许在单次质谱分析中比较多个样品。
Q4：如何选择合适的标记定量方法？
A4：这取决于您的样本类型、实验规模和研究目标。
1、如果您使用的是活细胞，并且需要在细胞水平上进行精确定量，请使用 SILAC。该方法非常适合动态研究，例如时间进程实验或治疗反应，因为标记发生在细胞生长过程中。
2、iTRAQ 适用于组织或体液样本，可为中等通量研究提供良好的灵敏度和可重复性。
3、TMT 也适用于组织和体液样本，是高通量研究的首选，每次运行最多可进行 18 个样本的多重分析。
还需要考虑仪器兼容性、所需的多重分析水平和预算等因素。
Q5：iTRAQ/TMT定量中为何采用 MS² 而不是 MS¹ 进行 reporter 离子定量？
A5：在iTRAQ和TMT实验中，所有标记肽段都是同量异位素的——它们在MS¹水平上具有相同的质量数，并且在色谱分析过程中会共流出。因此，在MS¹扫描中无法区分它们。在MS²碎裂后，每个标记肽段都会释放出具有不同m/z的独特报告离子，因此可以根据这些报告离子的强度对每个样品进行精确定量。
Q6：标记定量能否用于绝对定量？
A6：是的，基于标记的定量蛋白质组学可以用于绝对定量，但需要使用已知浓度的标准肽段或蛋白质进行校准。在该方法中，通过加入已知浓度的合成肽段或蛋白质来生成标准曲线。通过将报告离子的强度（在 iTRAQ/TMT 中）或 MS¹ 峰强度（在 SILAC 中）与标准曲线进行比较，研究人员可以计算出样品中目标蛋白的绝对浓度。然而，这种方法比相对定量更复杂，因为它涉及额外的校准步骤，通常用于需要精确定量蛋白质含量的情况。
Q7：哪些样本可以在同一批TMT或iTRAQ实验中混合分析？
A7：建议将来源一致、处理条件明确且具有可比性的样本安排在同一TMT或iTRAQ批次中，例如同种细胞或组织在“对照 vs 药物处理”条件下的比较。不同组织（如肝脏、脑组织、肌肉等）蛋白组成和复杂度差异显著，混合标记可能导致高丰度蛋白掩盖低丰度信号，降低鉴定通量和定量准确性。此外，应避免将不同批次采集或处理的样本放入同一标记组，以减少技术误差干扰。总之，TMT/iTRAQ实验应最大限度保持样本在生物背景和实验条件上的一致性，以确保数据的科学性和可比性。
Q8：不同组织间TMT信号偏移是否可以通过数据归一化处理解决？
A8：部分偏差可以通过总强度归一化、中位数校正等方法进行技术层面的调整，但如果生物本底差异过大，归一化往往会掩盖真实差异或放大假阳性。因此，数据预处理不能替代科学的实验分组。
Q9：利用SILAC稳定同位素标记细胞后，多长时间可以提取细胞蛋白进行后续质谱鉴定？
A9：SILAC为体内标记，其随着细胞增殖对蛋白进行标记，通常需要连续传代至少5–6代（population doublings），确保细胞内的天然氨基酸（如Lys、Arg）被同位素标记的氨基酸完全替代。具体时间因细胞类型而异。标记是否完全，可以通过质谱预实验检测标记效率，标记率需 ≥95% 才适合进行正式的SILAC质谱分析。
Q10：TMT实验中，如何评估样本之间的混合是否均一？
A10：可在标记前后分别取少量样本进行SDS-PAGE定量比对，标记后也可在MS中查看各reporter离子强度是否大致均衡，若偏差大需重新标记或混合。
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