如何使用SEC-HPLC进行蛋白质纯度与均一性分析？

在生物制药及生命科学研究中，蛋白质的纯度与均一性是关键质量属性（CQA），直接影响生物制品的安全性、有效性及稳定性。尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）以其高分辨率、温和分离和定量能力，已成为蛋白质纯度及聚集状态分析的核心技术。本文将介绍SEC-HPLC的原理、操作要点、关键参数及数据解读方法。

 

一、SEC-HPLC的原理与优势

SEC-HPLC（Size Exclusion Chromatography-High Performance Liquid Chromatography）基于分子体积大小进行分离。色谱柱内填充多孔硅胶或高分子凝胶材料，蛋白质分子在流动相中通过“筛分效应”进入或排除孔隙，分离以分子体积为依据。大分子因无法进入孔隙而快速洗脱，小分子则被延迟。

主要优势包括：

• 高分辨率与良好重现性：可区分蛋白单体、寡聚体及聚集体；

• 温和分离条件：非变性分离，保持蛋白结构与活性；

• 定量能力突出：紫外吸收等检测器可实现组分定量分析；

• 适用范围广：涵盖单克隆抗体、疫苗、重组蛋白、酶等多种生物制品。

 

二、样品制备与系统优化

1、样品准备

为确保柱效和数据准确性，样品需严格预处理：

• 使用0.22 µm过滤器去除颗粒杂质，避免堵塞柱床；

• 缓冲液与流动相匹配，保持蛋白稳定性，避免因缓冲液不同引起基线漂移或峰变形；

• 控制样品浓度，过高可能导致柱过载和峰展宽，过低则信号不足。

 

2、色谱柱与流动相

选择合适孔径（如300 Å或更高）和粒径（3–5 µm）的SEC色谱柱，确保分离蛋白质单体与聚集体。流动相多采用生理盐浓度（如150 mM NaCl）和中性缓冲液（如磷酸盐缓冲液），以减少非特异吸附并保持蛋白构象。优化流速（一般0.2–0.5 mL/min）以兼顾分辨率与分析时间。

 

3、系统验证

SEC-HPLC分析前应进行系统适用性验证，包括：

• 柱效（理论塔板数）；

• 保留时间重现性（RSD<1%）；

• 峰面积线性范围；

• 分子量校准曲线的准确性（不涉及具体标准物质品牌）。

 

三、检测与数据分析

常用检测器为紫外检测器（UV），检测波长一般为280 nm，适合蛋白质芳香族残基吸收特性。对于复杂样品，可引入多角度光散射（MALS）和示差折光（RI）检测，获取分子量分布与浓度信息。

数据解读关键指标包括：

• 纯度评估：主峰面积占总峰面积的百分比，反映蛋白纯度；

• 均一性分析：考察单体峰对称性、半峰宽（FWHM）、保留时间是否稳定；

• 聚集体检测：早洗脱峰（大体积）指示高分子聚集体含量；

• 降解产物识别：晚洗脱峰（小体积）可能指示低分子降解产物；

• 分子量确认：利用分子量校准曲线，推算各组分分子量，结合MALS检测结果验证均一性。

 

四、SEC-HPLC在生物制药中的应用价值

SEC-HPLC在生物药物开发的多个环节扮演关键角色：

• 药物研发：监测重组蛋白、单抗制备过程中的纯度和聚集体含量；

• 工艺开发：优化上游表达与下游纯化工艺，确保最终产品的质量；

• 质量控制：作为放行与稳定性检测的重要手段，评估批间一致性与长期稳定性；

• 法规符合性：符合ICH Q6B等国际质量规范要求，支持注册申报资料。

 

SEC-HPLC因其温和、高分辨率及定量能力，已成为蛋白质纯度与均一性分析的核心技术。通过合理的样品准备、系统优化及数据解读，可全面评估蛋白质量属性，识别聚集体及降解产物，确保产品安全与有效性。百泰派克生物科技依托先进的SEC-HPLC平台与经验丰富的分析团队，提供从方法开发、系统验证到样品分析的一站式解决方案。我们的服务涵盖多种生物药及复杂蛋白产品，确保结果具有高分辨率、良好重现性及可比性，满足从研发到生产质控的多层次需求。

 

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