肽组学分析流程图解：从样本准备到数据解读
肽组学（Peptidomics）分析是一种系统性地研究生物体系中肽分子的技术，常用于研究信号肽、激素肽、降解产物等生物活性肽。肽组学分析流程是一个从样本 → 肽识别 → 差异分析 → 功能解读的系统路径，其核心意义在于发现并理解体内具有功能性的肽分子及其生物学角色。系统性地识别、定量和解释生物体中内源性肽分子，以揭示其生物功能、生理调控机制及疾病相关性,是精准医学和系统生物学研究的重要工具。
一、肽组学分析的意义
1、生物活性肽的系统鉴定
（1）肽组学分析可识别内源性短肽（如激素、信号肽、抗菌肽等），这些肽具有重要的生物活性，往往不通过基因表达直接体现。
（2）有助于发现新的调节分子，揭示组织间信号交流或细胞内调控机制。
2、病理机制的探索
（1）通过比较健康组与疾病组样本中的肽谱差异，可识别与疾病发生、发展相关的肽段。
（2）应用于癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病等研究，有助于挖掘疾病标志物和靶点。
3、生物标志物的发现
（1）肽分子稳定性较好，存在于多种体液中（血液、尿液、唾液等），适合作为非侵入性检测的候选生物标志物。
（2）通过定量肽组学，识别疾病特异性差异表达肽，有助于早期诊断和疗效监测。
4、衍生蛋白降解机制的研究
（1）许多肽是蛋白质降解的中间产物，肽谱变化反映了蛋白水解酶的活性状态。
（2）可用于研究蛋白代谢通路、蛋白酶调控网络等。
5、对蛋白质组学的补充
（1）肽组学更注重短肽层级的信息，能揭示传统蛋白质组学中未能关注的小分子调控成分。
（2）特别适用于研究非翻译蛋白产物、剪切产物、降解碎片等。
6、跨学科应用拓展
（1）与代谢组学、转录组学、蛋白组学联合使用，能更全面地构建生物网络图谱。
（2）可在药物开发、营养学、毒理学、精准医疗等领域提供支持。
二、样本采集与前处理
1、目标：获取高质量、代表性样本，排除干扰物
2、常用样本类型：组织（如癌组织）、细胞、血浆、细胞培养上清等
3、注意事项：
（1）采样时间、温度精确控制，防止肽降解或降酶活性遗传
（2）使用EDTA/蛋白酶抑制剂，快速离心、冷冻保存
三、蛋白/肽提取与纯化
1、目标：将复杂样本中的肽与蛋白高效提取并去除干扰成分
2、通用方法：使用含SDS、尿素、盐离子溶液进行裂解；随后采用滤膜、凝胶或固相萃取手段（SPE、C18）除盐、脱脂
3、解决挑战：去除色素（如血清蛋白）、去除脂类，保证质谱信号清晰
四、酶切与肽段生成
1、目标：将大分子蛋白切割成适合质谱检测的肽段
2、常用酶：胰蛋白酶（Trypsin）—特别适合生成带赖氨酸或精氨酸结尾的肽段
3、条件优化：pH ≈ 8.0、37 °C、12–16 h；防止非特异性切割
4、技术点提示：双酶策略（联合胰蛋白酶+Lys-C）可提高覆盖度与重复性
五、肽段分离与液相色谱系统（LC）
1、目标：分离复杂肽混合物，提升后续质谱检测信噪比
2、主流手段：反相液相色谱（RP-LC），常用C18柱；梯度洗脱方案，流速与梯度时间精细调控
3、可扩展技术：多维色谱（如强阳离子交换HX-LC+RP-LC）适用于非常复杂样本
六、肽组学分析之质谱检测（Mass Spectrometry）
1、目标：对分离后的肽段进行高分辨/高精度检测
2、主流仪器类型：
（1）Orbitrap：高分辨率、高质量准确度，适合复杂样本高通量分析
（2）Q-TOF：快速扫描速度，适合定性分析
（3）Ion Trap + 动态排除：增强灵敏度
3、检测方式：
（1）DDA（Data-Dependent Acquisition）：选择强信号肽段实时碰撞（CID/HCD）破碎
（2）DIA（Data-Independent Acquisition）：同时收集全谱段信号，适合定量分析
4、行业趋势：越来越多研究趋向使用 DIA 和图谱库结合的定量策略，以提高复现性与覆盖率。
七、数据处理与定量分析
1、目标：从质谱Raw数据中识别肽序列，进行相对/绝对定量
2、工具汇总：
（1）Byonic/MaxQuant（DDA）：肽段匹配、QC、FDR过滤
（2）Spectronaut/ScaffoldDIA（DIA）：图谱匹配、定量分析
（3）Perseus/RStudio：差异分析、可视化
3、关键参数：
（1）FDR ≤ 1 %，肽段长度 7–30 aa
（2）信号归一化方法（iBAQ、LFQ、TMT、SILAC 等）
八、生物信息学解读
1、目标：将差异表达肽转换为生物学意义清晰的机制解释
2、常用注释系统：
（1）GO、KEGG、Reactome
（2）激活通路、蛋白-蛋白互作（PPI）、上游转录调控分析
（3）可视化工具：Cytoscape、R/Shiny等
九、肽组学分析流程图示意
1、样本准备
2、蛋白质提取
3、蛋白质预处理（去除高丰度蛋白、还原/烷基化等）
4、蛋白酶解（可选，若分析内源肽则跳过）
5、肽段富集（固相萃取、过滤、分子量切割等）
6、液相色谱（LC）分离
7、质谱分析（MS/MS）
8、原始数据获取
9、数据库搜索（匹配肽段，鉴定肽序列）
10、定量分析（标签法/无标签法）
11、生物信息学分析（GO/KEGG通路、聚类、网络分析等）
12、数据解读与生物学意义挖掘
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