为什么交联会影响FFPE蛋白质组学？如何减轻其影响？

在组织样本保存中，福尔马林固定-石蜡包埋（FFPE）是一种广泛应用的标准方法，尤其在临床病理领域。然而，FFPE处理带来的蛋白质交联（crosslinking）现象，给后续的蛋白质组学分析带来了显著挑战。

一、什么是FFPE中的蛋白质交联？

FFPE样本的核心处理步骤包括：

1、使用10%中性缓冲福尔马林对组织进行固定。

2、将组织脱水后包埋进石蜡中以实现长期保存。

在福尔马林固定过程中，甲醛与蛋白质的氨基酸残基（特别是赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸等）发生共价交联，形成亚甲基桥结构。这种交联结构稳定但非天然，会严重影响后续蛋白质组学研究所依赖的酶切、提取和鉴定过程。

二、FFPE交联如何影响蛋白质组学分析？

1、蛋白质提取效率降低

交联后的蛋白质结构更紧密、不易溶解。标准裂解液难以高效破碎这些复合物，导致蛋白提取率明显下降。

 

2、酶切效率受阻

蛋白质酶切依赖蛋白质的开放结构。交联后，酶切位点被遮蔽或结构阻碍，使得胰蛋白酶（trypsin）等蛋白酶活性大幅下降，产生的多肽片段不完全、不规律，降低肽段可识别率。

 

3、质谱识别难度增加

交联会引入非天然修饰和质量偏移，肽段质量与数据库中的理论值不符，从而增加搜索空间和识别错误率，影响定量和鉴定的准确性。

 

4、可变修饰和伪肽段增多

甲醛交联引入的新结构可能被错误识别为天然修饰，影响生物信息学分析的特异性。

三、如何减轻交联对FFPE蛋白质组学的影响？

尽管交联带来挑战，但通过方法学优化，可以显著改善FFPE样本的蛋白质组数据质量。以下为几种主流且实用的策略：

1、优化样本预处理

（1）去石蜡（Deparaffinization）

采用二甲苯（xylene）+梯度乙醇充分去除石蜡，避免影响后续裂解步骤。

（2）高效裂解系统

使用含SDS、TEAB、或8M尿素的裂解液，在高温高压（如加热至95°C）或微波辅助条件下，提高交联蛋白的溶解效率。

 

2、增强去交联效率（De-crosslinking）

（1）热诱导逆交联

在高温条件下（如90~100°C，数小时）进行热解处理，打断亚甲基桥，恢复部分天然结构。

（2）酸/碱辅助去交联

在酸性条件（pH~3）或碱性环境（如Tris-HCl，pH 9.0）下配合加热，有助于断裂交联键。

（3）添加辅助试剂

部分研究采用去交联缓冲液（如Antigen Retrieval Buffer）或DEPC辅助裂解增强蛋白释放。

 

3、酶切策略调整

（1）延长酶解时间

为了克服酶切位点遮蔽，可延长酶解时间至16-24小时，甚至双酶（Trypsin + LysC）联合使用。

（2）FASP或SP3等方法结合

使用滤膜辅助样本制备（FASP）或磁珠纯化方法（SP3）可提高酶解效率并减少样本损失。

 

4、质谱和数据库优化

（1）使用专用数据库

引入考虑交联修饰的数据库（如将甲醛相关修饰作为可变修饰项），提升肽段匹配效率。

（2）调整搜索参数

在MaxQuant、PEAKS、MSFragger等分析软件中，开启非特异酶切（semi-specific）模式、设定甲醛相关修饰，有助于发现“非标准”肽段。

四、百泰派克生物科技的解决方案：提升FFPE蛋白质组数据质量

在百泰派克生物科技，我们针对FFPE样本的复杂性，开发了一整套优化质谱蛋白组学流程，包括：

• 专属去交联裂解缓冲系统。

• 热诱导与酶法联合处理策略。

• 高灵敏度质谱平台（如Orbitrap Fusion Lumos、Exploris 480）。

• AI辅助的数据库搜索算法，提升低丰度蛋白识别率。

借助这些定制化手段，我们可在FFPE样本中实现>6000个蛋白质的高覆盖度鉴定，并保持良好的重复性（CV < 15%），广泛应用于癌症标志物发现、病理组织机制研究等领域。

尽管FFPE处理引入蛋白交联影响质谱分析，但随着方法的不断优化，其在临床样本利用和转化医学研究中的价值正在被逐步释放。对于需要挖掘FFPE样本蛋白组信息的研究者而言，选择具备经验的服务平台，如百泰派克生物科技，将有助于提升实验效率与数据可用性。

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