多糖中单糖组成分析
多糖（Polysaccharide）是由糖苷键结合而成的糖链，其结构单元是单糖。多糖的单糖组成是表征其结构的重要参数，不同多糖的单糖组成及含量不同，药理活性存在很大区别。检测多糖中单糖的组成及含量时，通常采用酸水解和酶水解的方法破坏糖苷键，将多糖水解成单糖，再对单糖组成进行分析，主要包括FT-IR法、PMP柱前衍生化HPLC法和液相-质谱法（图1）。
图1. 多糖中单糖组成分析示意图
一、傅里叶变换红外光谱（FTIR）
红外光谱分析是一种利用单糖分子吸收红外光谱的方法，不同的单糖具有不同的红外光谱吸收峰，通过测定多糖的红外光谱图谱，可以确定其中单糖的组成。傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform infrared spectroscopy，FTIR）技术具有检测速度快、操作方便、可同时分
析多种化合物、安全环保等特点，因具有指纹性可以快速的找到相关官能团的信息，其对目标化合物进行定性分析和定量预测。其测定原理是：分子由原子组成，原子以一定的频率振动，若一束红外光照射在样品上，原子吸收光子能量发生跃迁，即入射光的光子能量刚好满足 2 个振动能级之差（ΔE = E1-E2），这些变化产生在得到的干涉图上，利用傅里叶变换技术，得到红外光谱。通过红外光谱可鉴定化学物质的官能团、分析多糖中单糖的组成、测定蛋白质的二级结构等。
图2. FTIR法测定多糖中单糖组成分析流程图
二、PMP柱前衍生化HPLC法
HPLC法稳定性好，色谱柱类型较多，技术相对成熟，但糖类化合物紫外吸收较弱，通常采用衍生化的方法使其形成具有较强紫外吸收的衍生物。一般步骤为将多糖水解成单糖，加入衍生化试剂，如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），一种酸性化合物，可与还原糖发生醛基反应，产生强烈的紫外吸收，从而可以对单糖进行较为准确的检测。其他的衍生化试剂还有糖醇乙酸酯、甲醚、三甲基硅烷基肟、三甲基硅醚等化合物。近年来，PMP柱前衍生化HPLC法由于其操作简单，方法灵敏，结果准确，被广泛应用于多糖中单糖组成分析。
图3. PMP柱前衍生化HPLC法用于多糖中单糖组成分析流程图
三、液相色谱质谱联用（LC-MS）
传统单糖组成的测定方法有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、等。质谱（MS）是一种高通量的方法，具有分辨率高、灵敏度高、给出精确的分子质量等优点。液相色谱质谱联用技术（LC-MS）将色谱的分离能力和质谱的结构鉴定性能相结合，利用衍生化方法，提高了分析物的分离效率，是一种强有力的糖类结构分析技术，该法缩短了分析时间，在复杂样品的分析中应用广泛，具有较好的应用前景。另外在进行色谱分析时，由于存在立体异构体或其他化合物的共洗脱问题，通常会使得分离难度较大。相比于色谱分析，采用LC-MS检测降低了色谱分离的难度，且由于其高灵敏度、稳定性、可选择性和易操作性，在单糖组成上的应用越来越广泛。
图4. 基于液相-质谱法测定多糖中单糖组成分析流程图
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