考马斯亮蓝法测定蛋白质的影响因素
蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分，在生命体内参与细胞构建、物质运转、营养代谢、激素调控和酶促反应等多种生命活动，在生物体发育过程中几乎参与所有重大生命事件。因此，对蛋白质含量的测定，是生命科学研究领域中最常用检测手段，对其定性、定量分析是功能分析、药品检验、疾病诊断、临床检验中最基础的分析方法之一。目前，常用的蛋白质测定方法有凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法等。这里介绍考马斯亮蓝法测定蛋白含量的原理及影响因素。
一、考马斯亮蓝法测定蛋白含量的原理
自 1976 年 Bradford 发明快速测定微克量蛋白质的考马斯亮蓝法（G250）以来，考马斯亮蓝法便以灵敏、精准、便捷等测定优势得到迅速的推广和广泛的应用，因此考马斯亮蓝法又称 Bradford法。考马斯亮蓝 G-250 是一种甲基取代的三苯基甲烷，与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465 nm 变成595 nm，通过测定595 nm 处光吸收量建立与染料结合蛋白质的量（图1）。蛋白质和染料结合 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
图1. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的原理图
二、考马斯亮蓝法测定蛋白质的影响因素
鉴于每种蛋白质测定方法都有各自的局限性和优缺点，不能在任何条件下适用于各种蛋白质类型检测，需考虑到测定过程中的干扰物质、蛋白质性质、外界环境理化因子影响等多种因素，为提升蛋白质测定结果的精准性，需要对蛋白质测定方法的影响因素进行讨论归纳，下面介绍制药企业经常使用的考马斯亮蓝法测定蛋白质的影响因素，为实际操作过程遇到的问题提供一定的参考。
2.1 光照对考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的影响
有研究表明黑暗条件下用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度最接近标准值，正常自然光对测定结果与黑暗条件相比误差率显著增加，在阳光下测定蛋白质浓度误差率极显著，可能是考马斯亮蓝分子结构对光照敏感，导致考马斯亮蓝分子结构的改变引起聚集体发生不同程度聚集，最终导致该显色剂吸收光谱发生变化，引起对蛋白质测定结果的较大波动。
2.2 蛋白浓度对考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的影响
有研究利用考马斯亮蓝测定蛋白浓度（范围在 0 ～ 100 μg /mL），考马斯亮蓝测定高浓度蛋白质（≥50 μg /mL）结果比测低浓度蛋白结果更准确（＜ 50 μg /mL），并且在光线作用下被测定蛋白质浓度越高测定结果越准确，可能是蛋白质与考马斯亮蓝染料结合后，蛋白质浓度越高与显色剂结合越稳定，因此对光线干扰产生一定的保护作用。虽然如此，还是不建议使用考马斯亮蓝法测定接近 100 μg /mL 蛋白质浓度，因为该浓度是考马斯蓝测定的最大极限，对于超出该浓度的未知蛋白质浓度检测会造成直接的误差。
2.3 蛋白质与考马斯亮蓝孵育时间对考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的影响
研究发现在黑暗和弱光条件下 50 ～ 75 μg /mL 浓度蛋白质与考马斯亮蓝孵育 30 min 以内误差率较低并保持较稳定状态，随着时间的延长误差率显著增加。有研究表明考马斯亮蓝染料性质并不稳定，尤其是在光线照射直接对显色剂产生影响，虽然蛋白质浓度较高时会产生一定的保护，但是稳定时间并不长。因此，采用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度的操作过程中应该在黑暗条件下快速完成测定工作，尽量避免光照和孵育时间过长产生的较大误差。
2.4 温度对考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的影响
在蛋白质浓度为 0～ 100 μg/mL 进行考马斯蓝测定实验中，20 ℃时考马斯亮蓝法测定的蛋白质浓度与标准蛋白浓相比差异最小，提示可以在略低于室温下进行考马斯蓝法测定蛋白浓度。
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