磷酸化位点质谱

蛋白磷酸化是一种常见的翻译后修饰，能够调控细胞内的许多生物学过程，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化。大多数磷酸化蛋白不只含有一个磷酸化位点，磷酸化位点对于蛋白质的运输和功能至关重要，因此对蛋白质的磷酸化位点进行分析，有助于我们全面了解蛋白质的功能和调控网络。

质谱技术是一种强大的分析技术，随着生物信息学和蛋白质组学的发展，质谱技术已成为研究蛋白质磷酸化位点的重要工具，常用的方法有以下几种：

以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）为基础的方法

• 磷酸酶法：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽会丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。

• 磷酸肽亚稳离子法：离子源内产生的离子在真空无场飞行管道飞行过程中会发生结构断裂，丢失中性分子产生碎片离子（称为亚稳离子）。用反射式TOF检测器通过源后衰变分析母离子产生减少98或80的峰可判断是否为磷酸肽。如果发生硫酸化修饰则同样会产生类似的碎片离子，可以结合磷酸酶水解帮助判断。

• 正负离子检测：在负离子检测模式下，磷酸肽的响应信号强于正离子检测模式下的响应信号。

图2 利用MALDI-TOF-MS鉴定蛋白磷酸化位点

源后裂解（PSD)

利用特定的化学反应在质谱仪的离子源之后对离子进行裂解，可以生成含有磷酸基团的特定碎片离子。这些离子在质谱图谱中呈现出独特的质荷比，从而可以准确地区分磷酸化多肽与非磷酸化多肽。

电子捕获解离（ECD）

在ECD-MS中，蛋白质首先被固定在支持膜上，受到高能离子束的轰击后蛋白质发生解离，产生一系列的碎片离子。这些碎片离子包含了蛋白质的序列和修饰信息，包括磷酸化位点的信息。

以串联质谱各种扫描方式为基础的方法

• 中性丢失扫描：中性丢失扫描的核心在于监测中性丢失的质量，即磷酸基团（PO32-）的质量，从而确定磷酸化的发生。当中性丢失扫描被激活时，质谱仪会特别关注那些丢失了特定质量（如磷酸基团的质量，约98 Da）的离子。当蛋白质在质谱中解离成多肽片段时，如果某个多肽片段被磷酸化，那么在某个解离步骤中，该片段可能会丢失磷酸基团，从而形成一个中性分子。下一级质谱仪会检测到这种中性丢失，并确定磷酸化存在位置。

• 前体离子扫描：磷酸化肽经碰撞诱导解离（CID）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。

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