蛋白磷酸化怎么检测

蛋白磷酸化（Protein Phosphorylation）是生物体内最为常见也是研究最为广泛的一种蛋白质翻译后修饰。其原理是在蛋白激酶的催化作用下，将一个ATP或GTP的γ位磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基上，这一过程影响了人类细胞中超过1/3的蛋白质的功能。

图1 蛋白磷酸化示意图

蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。因此，对其进行检测显得尤为重要，常见的蛋白磷酸化修饰检测方法有以下几种：

1、32P 同位素放射性标记法

32P放射标记法是最经典的磷酸化蛋白检测方法，主要是通过纯化激酶及［γ－32P］进行体外标记，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸盐）平衡胞内的ATP水平进行体内标记，然后通过一维或二维凝胶电泳（1-或 2-DE）等分离技术对蛋白质进行分离，最后用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白。

2、蛋白免疫印迹法（Western Blot）

蛋白质样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，在胶面上会形成按分子量大小排列的清晰条带。随后将这些蛋白质转移到PVDF（聚偏氟乙烯膜）或NC膜（硝酸纤维素膜）上，与特异性磷酸化抗体结合，再用酶或同位素标记的二抗检测，通过显色或自显影观察磷酸化蛋白。

3、荧光染色法

Pro-Q Diamond 是一种专门标记磷酸化蛋白的荧光染料。通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白，对非磷酸化蛋白的反应性很低。荧光强度会随着蛋白磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化。该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用，同时展示出胶上的总蛋白谱和磷酸蛋白谱。

4、流式细胞技术

流式细胞术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品，通过检测标记荧光的荧光强度来确定所检测细胞或细胞因子的浓度。应用流式细胞技术检测荧光标记的磷酸化蛋白特异性抗体可以精确测量单细胞内的多参数磷酸化，可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高了工作量。

5、质谱法

质谱法原理是将蛋白多肽离子化，因质荷比不同，多肽在进入分析器时发生分离，通过测量分离肽段离子的相关参数，运用软件实现蛋白鉴定及功能分析。磷酸化蛋白肽段常不稳定，在质谱中会由于自发亚稳态分解或碰撞诱导裂解。利用磷酸酯酶处理后，磷酸化肽段易于丢失 H3PO4 或 HPO3，磷酸化丝氨酸或苏氨酸质量数丢失98 u，而磷酸化酪氨酸由于磷酸基团连接在苯环上只丢失80 u。质谱利用这些特征可以对磷酸化肽段进行鉴定。

6、Bio-Plex 悬液芯片

Bio-Plex 悬液芯片系统是美国伯乐公司开发提供的一个功能强大的芯片技术平台，该技术整合了软件包、系统校检工具、微球体偶联试剂和即用型细胞因子与磷酸化蛋白测试试剂盒，可在单个样品中同时分析多种生物分子，包括酶底物、受体、抗原或者抗体。经过悬液芯片多重检测获得的数据，更有助于从整体揭示生命分子间的相互关系及信号转导途径。

表1 不同蛋白磷酸化检测方法优缺点对比

检测方法	磷酸化检测类型	优点	缺点
³²P 同位素放射性标记法	蛋白磷酸化位点的检测；单个蛋白磷酸化检测	操作简单	只能在细胞中应用，比较局限且有放射性危险
Western blot 免疫沉淀法	单个蛋白磷酸化检测	检测蛋白特异性好，分辨率高	信号弱的磷酸化蛋白需要经过富集，且无法精确分析
荧光染色法	单个蛋白磷酸化检测	可以直接染色磷酸化蛋白凝胶，无需加入抗体；不妨碍后续蛋白质组磷酸化分析	对于不同的磷酸化位点，Pro-Q Diamond dye 的灵敏度差异较大
流式细胞技术	单细胞水平多参数磷酸化检测	精确测量单细胞内的多参数磷酸化，提高工作量	需要特异性荧光染料，耗费高、仪器贵
质谱法	蛋白磷酸化位点的检测	可以发现并测定磷酸化蛋白质的一级结构，可以确定蛋白的磷酸化位点	不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略
Bio-Plex 悬液芯片	单细胞水平蛋白磷酸化检测；多细胞水平高通量蛋白磷酸化检测	不局限单细胞水平，可同步检测细胞内多重磷酸化蛋白	对于因子抗体间有交叉反应的不能同时检测

鉴定蛋白质复合物样品中相关蛋白磷酸化修饰是蛋白质组学领域中的一个重要部分，目前已经有多种蛋白磷酸化分析方法，它们各有优缺点，可以根据实验需要进行选用。百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，为广大科研工作者提供蛋白质磷酸化检测一站式服务，只需要将您的需求告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责项目所有后续，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化或糖基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析所有事宜，并为您提供详细的中英文双语版技术报告，欢迎免费咨询。

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