IMAC富集磷酸化肽段的步骤

磷酸化修饰是一种可逆的蛋白修饰，调控蛋白活性，传递信号，是细胞健康和疾病的核心调控机制；真核生物中预计有三分之一的蛋白具有磷酸化修饰。

然而，磷酸化修饰的丰度很低，直接进行质谱（MS）检测，非磷酸化的肽段会造成很高的背景，因此磷酸化肽段需要进行富集后检测。此外，对样品磷酸化肽段预先分离纯化并进行富集也可降低样品复杂程度，从而改善磷酸肽的MS信号并提高MS检测深度。

固相金属亲和

最广泛使用的磷酸肽富集方法。其原理是根据蛋白质磷氨基酸上带负电荷的磷酸化基团与带正电荷的金属离子（如Fe³⁺）高度亲和的特性，在特定的溶液缓冲体系中金属离子能特异性结合磷酸化多肽从而达到富集的目的。

IMAC富集磷酸化肽段的步骤：以Fe³⁺-IMAC为例，首先，Fe³⁺-IMAC将Fe³⁺螯合到色谱固定相上，样品中磷酸肽段与Fe³⁺特异异性结合从而被选择性吸在固定相上。然后用磷酸盐或高pH溶液洗脱下富集的磷酸化肽段。IMAC富集方法可选择性的富集磷酸化肽段，对含有多个酸性残基的磷酸化多肽也同样具有非特异性结合吸附能力，这降低了该方法特异性富集磷酸化肽段的效率。因此，可通过优化洗脱溶液和新材料的开发（如Ti⁴⁺-IMAC、Fe³⁺-IDA-IMAC和Ga³⁺-Fe³⁺-IMAC）来拓宽IMAC法特异性富集方法的应用范畴。

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