AAE-MS在提升HCP抗体覆盖率检测中的作用
宿主细胞蛋白（HCP）作为生物制药中的关键工艺相关杂质，一直是质量控制与注册申报中的重点。HCP检测多依赖ELISA，而抗体识别范围的广度——即抗体覆盖率，是决定ELISA方法学有效性的核心因素。在抗-HCP抗体覆盖率验证方面，二维Western印迹法（2D-Western Blot）是公认的“图谱型金标准”，通过蛋白点数量对比计算覆盖率。然而，它仅能告诉我们抗体识别了多少“点”，却无法回答被识别的是哪些蛋白。这对药品质量风险评估、免疫原性分析和抗体筛选存在天然盲区。免疫亲和富集-增强质谱（AAE-MS），正是在此背景下被提出并快速发展。它将抗体捕获能力与高分辨质谱联用，不仅可精准识别抗体实际识别的HCP种类，还可用于量化其丰度，为提升HCP抗体覆盖率检测力提供更具深度和分子分辨力的视角。
一、AAE-MS技术原理与流程概览
1、AAE-MS基本原理
AAE-MS（Affinity-Assisted Enrichment Mass Spectrometry）是一种将抗-HCP抗体偶联于固相基质上，用于富集目标蛋白，再通过质谱进行蛋白鉴定和定量的策略。
2、AAE-MS标准化流程
（1）抗体固定：将待验证的抗-HCP抗体偶联至Protein A/G磁珠或Sepharose树脂
（2）样品孵育：与HCP混合样品充分孵育，使抗体结合其识别蛋白
（3）洗脱与酶解：洗去未结合杂质，保留免疫复合物并进行酶解处理
（4）质谱分析：使用LC-MS/MS识别富集蛋白的具体种类和丰度
（5）结果分析：比对总HCP蛋白谱，评估抗体“识别种类”与“识别偏好”
二、AAE-MS 在抗体覆盖率评估中的关键优势
1、提供蛋白种类层面的识别信息
二维Western只能看到“多少个蛋白点”，而AAE-MS能够明确识别出被抗体识别的每一个蛋白ID，包括其功能、分子量、等电点、免疫原性预测等属性。
2、识别能力不依赖电泳分离效果
2D-WB中弱表达蛋白或位置重叠蛋白可能被漏算，而AAE-MS对低丰度蛋白具有更高的检测灵敏度，避免点位统计误差。
3、覆盖率定量更精细
可输出：
（1）被识别蛋白数量 vs 总HCP蛋白数量
（2）丰度分布图
（3）被识别蛋白的功能注释与生物学风险预测
4、识别“盲区”抗体
可用于发现哪些高风险HCP未被当前抗体识别，为新抗体设计、补充免疫原策略提供依据。
三、AAE-MS 在抗-HCP抗体开发与申报中的应用场景
1、通用 vs 定制抗体对比评估
（1）用于评估商业通用抗体是否覆盖项目特定HCP谱
（2）支持多个抗体候选进行覆盖率排序，为定制开发决策提供定量依据
2、补充二维Western验证结果
（1）二维Western覆盖率≥70%时，AAE-MS可用于确认识别种类是否覆盖已知高风险HCP
（2）二维Western覆盖率偏低时，AAE-MS有助于判断“识别范围窄”是否为功能性缺失
3、用于CMC申报的深度佐证
（1）支持提交至FDA/EMA作为“蛋白种类识别”材料
（2）符合 ICH Q6B 对杂质“定性+定量+生物风险识别”的要求
AAE-MS的出现，为HCP抗体覆盖率验证带来了质的飞跃。相比二维Western图谱的点位统计，AAE-MS提供了更具深度、分子分辨率和可追溯性的识别信息，帮助生物制药企业更科学地评估抗体性能、控制检测盲区，并满足国际注册要求。百泰派克生物科技已将AAE-MS成功应用于多个mAb、重组蛋白和疫苗项目，协助客户实现HCP抗体验证的定量升级与风险最小化，助力药品质量体系更合规、更可控。
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