外泌体蛋白质组分析常用哪些技术？

外泌体（Exosomes）是由多种细胞分泌的小膜性囊泡（30–150 nm），作为细胞间信息传递的重要媒介，广泛参与肿瘤转移、免疫调节、神经退行性疾病等过程。随着外泌体研究热度持续攀升，蛋白质组学作为解析其功能和生物标志物的重要手段，正受到越来越多生命科学研究者的重视。但由于外泌体颗粒小、来源复杂、蛋白丰度跨度大，外泌体蛋白质组分析面临较高技术挑战。

一、外泌体样本的分离与纯化

在外泌体蛋白质组分析前，必须获取高纯度的外泌体。当前常用的分离策略包括：

1、差速超速离心

（1）流程：通过多级离心（如300×g，2,000×g，10,000×g，100,000×g）去除细胞碎片、大囊泡和杂质，沉淀外泌体。

（2）优点：操作经典，易于标准化。

（3）缺点：纯度有限，容易带入蛋白复合物或脂蛋白颗粒。

2、密度梯度离心

（1）原理：利用蔗糖或OptiPrep梯度根据密度分离外泌体与其他微粒。

（2）特点：纯度更高，适合需要下游质谱分析的项目。

（3）挑战：耗时较长，实验操作较为复杂。

3、免疫亲和捕获

（1）方法：使用CD9、CD63、CD81等标志蛋白抗体富集外泌体。

（2）适用场景：特定细胞来源的外泌体富集、高特异性研究。

（3）注意事项：可能影响外泌体完整性，且成本较高。

4、商品化试剂盒

（1）优势：操作简单、重复性好，适合大样本规模的研究。

（2）限制：分离效率依赖于样品类型和柱子规格。

二、蛋白提取与定量

高效而温和的裂解是外泌体蛋白质组分析的关键一环。通常采用含有SDS或RIPA的裂解液，配合蛋白酶抑制剂避免蛋白降解。提取后的蛋白需进行：

（1）浓度测定：常用BCA法，适用于含去污剂的裂解液。

（2）蛋白质量检测：SDS-PAGE 可用于初步评估蛋白样本的完整性。

有时，还需要进行蛋白还原、烷基化和酶解处理（如Trypsin消化），为后续LC-MS/MS分析做准备。

三、核心技术平台

外泌体蛋白质组分析主要依赖高分辨率液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术。目前主流策略包括：

1、DDA（Data Dependent Acquisition，数据依赖采集）

（1）流程：先获得全扫描图（MS1），自动选择最强信号的前N个肽进行碎裂（MS2）。

（2）特点：适合构建谱图库和探索性研究。

（3）不足：重现性相对较低，对低丰度蛋白覆盖率有限。

2、DIA（Data Independent Acquisition，数据非依赖采集）

（1）原理：将整个质谱扫描范围划分为若干窗口，对所有肽段并行碎裂采集。

（2）优势：重现性好、数据完整性高，适合定量比较分析。

（3）应用场景：大规模差异蛋白筛选、疾病标志物研究。

3、PRM/MRM（Parallel/Multiple Reaction Monitoring，靶向质谱）

（1）用途：对已知蛋白进行高灵敏度定量验证。

（2）平台：PRM 依赖高分辨质谱仪（如Orbitrap），MRM多用于三重四极杆平台。

四、生信分析与功能解读

外泌体蛋白质组分析的价值最终体现于数据的深度解析，常见分析流程如下：

1、蛋白鉴定与定量

（1）软件工具：DDA常用MaxQuant、PD，DIA推荐Spectronaut或DIA-NN。

（2）数据库：Uniprot用于广泛蛋白注释，ExoCarta/Vesiclepedia用于外泌体蛋白对照验证。

2、差异分析与统计检验

（1）筛选标准：Fold Change >1.5 或 <0.67，p值 < 0.05。

（2）可视化方法：火山图、热图、主成分分析（PCA）。

3、富集分析与通路解读

（1）GO/KEGG注释：识别显著富集的生物过程、分子功能与信号通路。

（2）蛋白互作网络：使用STRING、Cytoscape构建外泌体相关蛋白互作图谱。

（3）疾病关联分析：结合DisGeNET等数据库，探索蛋白与疾病的潜在关联。

五、外泌体蛋白组技术在应用中的价值

1、肿瘤标志物筛选

外泌体作为非侵入式液体活检的理想载体，其表面和内含蛋白富含疾病特异性信号。通过外泌体蛋白质组分析，可识别癌症早期诊断、分型或治疗反应预测的新型标志物。

2、细胞通讯与信号转导研究

外泌体介导多种细胞因子与受体的转运，蛋白质组分析有助于揭示细胞间信号传导机制。

3、个体化医疗与药物靶点发现

结合临床信息，外泌体蛋白组数据可辅助药物反应预测、耐药机制研究以及新靶点挖掘。

外泌体蛋白质组分析正逐步成为揭示疾病机制与筛选生物标志物的重要工具。随着质谱技术与生信算法的不断进步，其在基础研究与临床转化中的应用潜力日益显著。百泰派克生物科技将持续深耕蛋白组学平台，助力科研人员实现从样本到数据、从发现到验证的高效闭环。如您对外泌体研究有任何疑问或需求，欢迎随时与我们联系。

百泰派克生物科技--生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

相关服务：

外泌体蛋白质组学