二硫键映射分析的原理与关键技术详解

在蛋白质尤其是治疗性蛋白药物（如单抗、融合蛋白、酶类等）中，二硫键（Disulfide Bond）是一种维持蛋白质空间结构和功能活性的重要共价键。其连接模式的正确与否，直接关系到蛋白折叠效率、稳定性、免疫原性甚至药效。由于在重组表达和制剂开发过程中，二硫键易出现错配（mispaired）、断裂（cleaved）或重排（scrambled），因此必须通过精准的二硫键映射分析（Disulfide Bond Mapping），确认蛋白质是否形成了预期结构中的二硫键网络。

 

一、什么是二硫键映射？

二硫键映射指的是通过蛋白质质谱技术，在非还原条件下识别和定位连接两个半胱氨酸残基的二硫键的具体配对模式，并与参考序列或预期结构进行比对分析。

映射的目标通常包括：

1、明确天然二硫键的连接位点

2、鉴定非天然二硫键/错配

3、检测二硫键的重排或缺失

4、进行变异体（variant）筛选与结构表征

 

二、二硫键映射分析的原理

 Step 1：非还原酶解

在保留二硫键的条件下对蛋白进行温和酶解（如胰蛋白酶、Lys-C等），酶解产物中将包含通过二硫键连接的交联肽段。

 

 Step 2：高分辨质谱检测

使用LC-MS/MS技术对酶解产物进行分析，系统可检测到由两个肽段通过一个二硫键连接而形成的“交联肽（disulfide-linked peptides）”，其质量为两段肽质量之和，减去两个氢（−2 Da）。

 

Step 3：数据库匹配与谱图确认

借助专业的数据库搜索算法（如Byonic、StavroX、MassMatrix等），自动识别交联肽的候选组合，并结合MS/MS碎片谱图手动确认。

 

Step 4：结构映射与比对分析

将已确认的二硫键配对模式与参考序列进行比对，判断是否存在非天然配对、缺失、重排或聚集诱导结构改变。

 

三、二硫键映射分析核心技术

1、多酶联合酶解策略（Protease Combinations）

使用胰蛋白酶往往无法覆盖所有二硫键连接区域。通过引入Lys-C、Glu-C等不同位点特异性的酶进行联合酶解，可提高交联肽段的检测概率，实现全覆盖分析。

 

2、高分辨率质谱平台

分析二硫键交联肽段对仪器性能要求极高，推荐使用如下平台：

（1）Orbitrap Fusion Lumos

（2）Q Exactive HF-X

（3）timsTOF Pro（结合PASEF提升灵敏度）

这些平台可在高质量分辨率下提供更精准的碎片信息，利于解析复杂交联肽。

 

3、特定离子碎裂技术

（1）CID/HCD（碰撞诱导解离）：适合识别肽段序列；

（2）ETD/EThcD（电子转移解离）：更适合保持二硫键结构，提供链间连接信息，尤其适用于高分子抗体或融合蛋白的结构解析。

 

4、软件算法支持

目前主流的二硫键分析软件包括：

（1）Byonic：商业软件，支持二硫键搜索模式、高容错性；

（2）pLink：开源软件，灵活配置交联位点和修饰；

（3）Disulfide by PEAKS：结合变异识别与二硫键映射。

 

四、百泰派克生物科技：精准可靠的二硫键映射分析

百泰派克生物科技结合领先的质谱平台与定制化分析流程，提供高灵敏度、高覆盖率的二硫键映射解决方案，

服务范围涵盖：

• 单抗、双抗、Fc-fusion蛋白
• 生物类似药一致性评估
• IND/NDA申报支持（CQA项目）
• 批间差异和结构变异分析

技术亮点包括：

• 多酶协同酶解 + 非还原策略
• Orbitrap平台高分辨质谱检测
• 专业数据库搜索与人工谱图注释
• 完整的图文报告和法规合规性支持

 

在结构驱动的生物药开发时代，二硫键映射不仅是质量表征的一部分，更是把握分子稳定性和功能活性的关键工具。科学的分析策略，结合先进的技术平台，是实现高质量蛋白药开发的前提。如您在抗体药物、蛋白工程、生物类似药开发过程中面临结构分析的难题，欢迎联系我们的技术专家。百泰派克生物科技将为您提供从项目设计到分析交付的一站式定制化二硫键映射分析服务。

 

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相关服务：

蛋白二硫键鉴定和定量分析