De Novo测序入门：原理、流程与应用

一、什么是De Novo测序？

De Novo测序（From Scratch Sequencing） 是一种不依赖任何已知参考序列或数据库，直接从实验数据中推断出生物大分子（如蛋白、DNA或RNA）序列的方法。在蛋白质组学中，它指的是：利用高分辨率质谱仪采集酶解多肽的MS/MS碎片数据，通过算法分析这些碎片离子，直接还原氨基酸序列，最终拼接出完整蛋白的一级结构。

 

二、De Novo测序的技术原理

De Novo测序的核心依赖质谱平台，尤其是高分辨率MS/MS技术。具体过程如下：

1、蛋白酶解：将目标蛋白用Trypsin、Chymotrypsin等酶消化为短肽段；

2、MS/MS采集：通过LC-MS/MS采集每个肽段的碎片离子谱图（b/y离子）；

3、谱图解析：De Novo算法识别峰值间的质量差，逐个推断氨基酸；

4、序列拼接：将多个肽段的结果重叠整合，构建完整蛋白序列；

5、人工校核与建模：对关键区段进行人工审阅、结构验证。

 

该方法的关键在于：碎片图谱质量是否足够清晰、肽段重叠是否充分、拼接逻辑是否严谨，决定了最终序列的准确率与覆盖度。

 

三、De Novo测序的标准流程

为了获得高质量的De Novo测序结果，通常包含以下几个步骤：

1、样本制备与质量评估

接受多种形式样本（蛋白溶液、PAGE条带、上清等），并评估浓度、纯度和背景干扰。如有需求，可进行Protein A/G亲和纯化或切胶处理，确保进入质谱前的样本处于理想状态。

 

2、多酶酶解与肽段富集

采用Trypsin、Chymotrypsin、AspN、LysC等多种酶并行消化，生成高重叠率的肽段集合，特别针对CDR等“结构盲区”提升覆盖度。

 

3、高分辨质谱采集

使用Orbitrap Fusion Lumos或timsTOF Pro平台，采集多轮HCD/CID/ETD碎片谱图，保证碎片完整性与质量准确度。

 

4、序列分析与拼接重建

整合PEAKS Studio、pNovo等多个De Novo算法结果，自研拼接工具进行全长序列重建，结合结构数据库进行片段归属识别。

 

5、结构建模与表达验证（可选）

提供cDNA反向翻译、结构预测建模、表达模板构建等后续服务，真正实现“从蛋白到功能”的闭环。

 

四、De Novo测序的应用

1、无法获得基因序列的抗体解析

常见于动物免疫抗体、临床血清抗体、已丢失表达载体的老抗体等。De Novo测序可直接从蛋白还原轻链/重链结构，用于表达复现或专利设计。

 

2、非模式生物蛋白组研究

在中药材、海洋生物、微生物等研究中，数据库缺乏或注释不全，传统方法无法进行蛋白识别，必须依赖De Novo还原序列。

 

3、癌症新抗原与突变蛋白发现

可在不依赖基因信息的前提下识别肿瘤突变体、新融合蛋白，为个体化免疫治疗提供精准靶点。

 

4、蛋白药一致性验证与修饰图谱分析

比较不同批次、表达系统、工艺条件下蛋白结构是否一致，捕捉细微突变或翻译后修饰（PTMs）差异。

 

5、已知蛋白但存在结构异构体

当蛋白本身有糖基化、氧化、剪切异构体等，De Novo测序配合修饰分析可还原真实表达状态，支持质量控制与功能评价。

 

在生命科学迈入结构功能深度融合的阶段，De Novo测序成为连接蛋白本体与功能应用之间的桥梁。它帮助研究人员突破数据库限制，从蛋白直接还原全结构信息，推动蛋白研究从“识别”走向“复现”。无论你是想解析一个天然抗体的结构、探索一个未知蛋白的功能，还是为一个蛋白药寻找“身份证明”，De Novo测序都值得作为你项目的关键技术选项。如您正在进行相关课题或项目设计，欢迎联系百泰派克技术顾问团队，我们将为您提供专业的技术咨询与样本评估。

 

百泰派克生物科技——生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

 

相关服务：

从头测序