De Novo测序常见问题解析
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样本越少，酶解重复性与覆盖度下降
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特异性修饰或微量异构体信息可能遗漏
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10 µg起始量的全序列解析
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特殊样本的微量富集（如IP抗体）
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“多轮重复 + 信息整合式解读”策略
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样本复杂度（纯化程度、修饰情况）
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是否需要PTM图谱、结构建模等增值内容
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是否需重组表达与功能验证
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临床来源多克隆抗体序列重建
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疫苗免疫小鼠B细胞抗体谱图解析
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专利抗体重建与结构比对验证
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特殊修饰抗体（如糖基化）全序列图谱重建
在蛋白质组学与抗体研究中，De Novo测序技术以其不依赖数据库、可还原完整蛋白序列的独特优势，成为科研人员和生物医药企业的重要工具。尤其在抗体序列解析、古蛋白重建、新型抗原发现等场景下，De Novo几乎是唯一可行的解决方案。然而，由于该技术涉及复杂的质谱数据解读与算法重建，许多科研人员在项目初期常常存在各种疑问。本文整理出在项目沟通中最常被问到的七大问题，并提供专业解析与建议。
Q1：De Novo测序到底能不能保证“100%准确”？
答案：理论上不能，实际上可以非常接近。
De Novo测序依赖的是肽段的质谱碎片图谱，准确性受限于：
（1）酶解覆盖度
（2）MS/MS碎片质量
（3）同位肽异构体分辨能力
在理想条件下（多酶酶解、高分辨率仪器、人工校核），可实现95%以上的序列还原准确率。CDR等关键区域通常会被重点覆盖与校验。百泰派克生物科技在项目中采用双平台并行+人工验证+结构建模辅助策略，确保提供的序列具备重组表达和功能复现能力。
Q2：必须使用纯化蛋白样本吗？能不能从血清或细胞上清直接测？
答案：不是必须，但推荐尽量纯化。
De Novo测序的前提是对目标蛋白进行高质量的酶解与碎片采集。在复杂背景下直接测定会引入大量干扰肽段，尤其是抗体中的轻链重链含量远低于其他血浆蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白家族成员）。
百泰派克生物科技可提供：
（1）蛋白A/G亲和纯化
（2）SDS-PAGE或SEC预纯处理
（3）特异性抗体pull-down技术
以确保即使是从血清、组织液或低表达细胞中，也能获得适用于De Novo测序的高纯度样本。
Q3：只要一台高分辨率质谱仪就能做De Novo了吗？
答案：不止仪器，算法和经验同样关键。
虽然Orbitrap、TOF等高端仪器能提供精准的碎片信息，但De Novo真正的难点在于：
（1）多酶酶解策略设计
（2）片段重叠拼接逻辑
（3）近似肽段的错配纠正
（4）数据后处理与人工干预能力
百泰派克使用自研算法融合主流软件（PEAKS、pNovo、Novor等），结合人工审校机制+结构模板匹配分析，实现从原始MS数据到可表达序列的完整转化。
Q4：De Novo能不能识别蛋白质的翻译后修饰（PTMs）？
答案：可以，但需要特别设计实验流程。
常见的翻译后修饰包括糖基化（N-型、O-型），磷酸化、甲基化、乙酰化，氧化、脱酰胺等。在De Novo测序中，修饰位点会影响碎片图谱的质量与解读算法的判断，因此需要：
（1）提前告知目标修饰类型
（2）选用适当的富集策略（如HILIC、IMAC）
（3）启用修饰搜索参数
Q5：CDR区这么关键，能确保100%还原吗？
答案：CDR还原准确性是核心评价标准。
抗体的互补决定区（CDR）是与抗原结合的关键结构，其序列高度多变，往往在公共数据库中无匹配项，因此只能依赖De Novo重建。我们通常采用：
（1）多种酶组合（Trypsin + Chymotrypsin + GluC）
（2）酶解重复覆盖
（3）CDR特异性富集算法
（4）与抗体结构模板进行序列预测交叉验证
从而实现对CDR的高准确率识别与还原，在多数项目中可达到CDR区95%以上的覆盖与100%功能还原。
Q6：如果我手头只有10 µg蛋白，还能做De Novo吗？
答案：可以，但建议>20 µg更稳妥。
现代高灵敏度质谱仪器已可在低样本量条件下进行MS/MS采集，但：
百泰派克已建立低样本量De Novo测序流程，支持：
Q7：项目周期多久？我多久能拿到抗体完整序列？
答案：标准项目为3-4周，急件可加速至10个工作日。
项目周期受以下因素影响：
百泰派克生物科技提供多种项目优先等级选择，技术团队支持从样本接收、项目设计、数据解读到下游表达一体化服务，确保您最快拿到可复现、可表达的抗体序列信息。
百泰派克生物科技：从De Novo到功能验证的一站式服务平台
作为质谱驱动的抗体研究服务提供商，百泰派克生物科技已累计完成200+例高难度De Novo抗体测序项目，包括：
我们坚持以“算法+经验+验证”三位一体的方法学策略，解决每一例高复杂度挑战，为科研客户提供真正可靠的技术支持。De Novo测序是一门技术壁垒高、数据处理复杂、解释自由度大的技术。理解其原理与边界，是每一位科研人员在项目启动前应掌握的基础。我们希望本篇常见问题解析，能够帮助您理性判断、精准沟通、科学规划实验流程。如您有样本准备、实验设计或技术细节问题，欢迎添加百泰派克技术顾问微信或访问官网在线留言，我们将第一时间为您提供个性化解决方案。
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